超高效液相色谱-串联四级杆质谱法测定水产品中硝基呋喃类代谢物的方法改进

包永华，王璐璐

(1.浙江经贸职业技术学院，杭州 310018；2.浙江方圆检测集团股份有限公司，杭州 310013)

硝基呋喃类药物(呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林)是一类人工合成的具有硝基呋喃基本结构的广谱抗生素，曾广泛应用于水产养殖业，治疗由大肠杆菌或沙门氏菌所引起的肠炎、疥疮、溃疡等[1]。该类药物及其代谢物具有潜在的致癌、致畸、致突变等毒副作用,因而引起人们的高度重视[2-3]。目前，全球大多数国家均将其列为禁用药物，硝基呋喃类药物及其代谢物残留是国际动物源性食品贸易的必检项目[3]。有关水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，主要有酶联免疫法(ELISA)[4]、高效液相色谱法(HPLC)[5]、液相色谱-紫外法[6]、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[7]、液相色谱-串联质谱法((HPLC-MS/MS)[8]、超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)[9]等。UPLC-MS/MS法能够充分发挥超高效液相色谱的高分离度、高分析速度与串联质谱的高特异性和高灵敏度的优势，成为检测水产品硝基呋喃类代谢物的最常使用的技术路线。本研究以国家标准GB/T 20752-2006[10](猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法)中的实验方法为基础，对样品前处理过程进行了优化，样品衍生后乙酸乙酯直接提取，确保在能达到低检出限要求的同时，控制回收率在90%～110%以内，RSD均小于10%。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 水产样品(鱼片、河虾、明虾、螃蟹)，购于杭州世纪联华超市。试剂：呋喃它酮代谢物(AMOZ)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，10 mg/瓶，纯度≥99.2%；呋喃西林代谢物(SEM)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，0.1 g/瓶，纯度≥99.5%；呋喃妥因代谢物(AHD)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，0.1 g/瓶，纯度≥99.38%；呋喃唑酮代谢物(AOZ)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，50 mg/瓶，纯度≥98.2%；呋喃它酮代谢物的内标物(D5-AMOZ)，WITEGA，10 mg/瓶，纯度≥99.10%；呋喃西林代谢物的内标物(13C15N-SEM)，WITEGA，10 mg/瓶，纯度≥99%；呋喃妥因代谢物的内标物(13C3-AHD)，WITEGA，100 mg/瓶，纯度≥99.10%；呋喃唑酮代谢物的内标物(D4-AOZ)，WITEGA，50 mg/瓶，纯度≥99.80%；2-硝基苯甲醛(C7H5NO3)，含量≥99.0%；二甲基亚砜(C2H6OS)，含量≥99%；乙酸乙酯，德国Merck公司，含量≥99.8%，规格4 L；磷酸氢二钾(K2HPO4)，含量≥98%；乙腈，德国Merck公司，含量99.9%，规格4 L。

1.2 仪器与设备 1290 Infinity高效液相色谱仪(Agilent Technologies公司)；QTRAP 5500 串联四极杆质谱仪(AB SCIEX公司)超纯水仪，美国Millipore公司；氮气吹干仪；分析天平：感量0.1 mg；离心机：转速4000 r/min以上。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：C18柱，100 mm×2.1 mm，1.7 μm；柱温:35 ℃；进样量:10 μL；流动相及流速见表1。

1.3.2 质谱条件 离子源：ESI；扫描方式：正离子扫描；检测方式：MRM；雾化气GS1：55.0 psi；辅助加热气GS2：55.0 psi；气帘气CUR：35.0 psi；辅助气温度TEM：600 ℃；喷雾电压IS：5500 V；入口电压EP：10.0 V；碰撞池电压CXP：12.0 V；碰撞气CAD：MEDIUM。4种硝基呋喃类代谢物及其内标物质谱条件参数见表2。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Program of gradient elution

表2 质谱条件Tab 2 Condition of mass spectrometry

* 为定量离子

1.3.3 标准溶液的配制 将呋喃它酮代谢物(AMOZ)，呋喃西林代谢物(SEM)，呋喃妥因代谢物(AHD)，呋喃唑酮代谢物(AOZ)及其相对应的四种内标物分别配制成浓度为1 mg/L的标样待用。

1.3.4 样品预处理 取样2 g，加入10 μL，浓度为1 mg/L的内标，20 mL 0.2 mol/L盐酸溶液，0.3 mL衍生剂，充分涡旋混匀后37 ℃恒温振荡水浴避光反应 16 h。衍生后加入5 mL磷酸氢二钾，混匀后用氢氧化钠溶液调节pH约为7.4。加入5 mL乙酸乙酯，充分振荡后离心提取上清液，重复操作两次，合并上清液，氮气吹干，加入定溶液1 mL复溶后过0.22 μm滤膜，上机待测即可。

2 结果与分析

2.1 标样质谱图 根据GB/T 20752-2006标准中要求，呋喃它酮代谢物(AMOZ)，呋喃西林代谢物(SEM)，呋喃妥因代谢物(AHD)，呋喃唑酮代谢物(AOZ)检出限为0.5 μg/kg。因此，按照改进步骤中的质量数，将配制好的标准溶液再次稀释后分别适量加入空白样的水产品中，使得四种硝基呋喃类代谢物标样上机浓度为1 μg/L，经过改进的实验方法处理后，进样分析(图1～图8)。

图1 呋喃它酮代谢物(AMOZ)定量及定性离子出峰质谱图Fig 1 The mass-spectrogram of AMOZ

图2 呋喃它酮代谢物的内标物(D5-AMOZ)出峰质谱图Fig 2 The mass-spectrogram of internal-standard for AMOZ

图3 呋喃西林代谢物(SEM)定量及定性离子出峰质谱图Fig.3 The mass-spectrogram of SEM

图5 呋喃妥因代谢物(AHD)定量及定性离子出峰质谱图Fig.5 The mass-spectrogram of AHD

图6 呋喃妥因代谢物的内标物(13C3-AHD)出峰质谱图Fig.6 The mass-spectrogram of internal-standard for AHD

图7 呋喃唑酮代谢物(AOZ)定量及定性离子出峰质谱图Fig.7 The mass-spectrogram of AOZ

图8 呋喃唑酮代谢物的内标物(D4-AOZ)出峰质谱Fig.8 The mass-spectrogram of internal-standard for AOZ

从图1～图8出峰质谱图来看，呋喃它酮出峰时间在2.06 min，峰高最大值4.0 e5cps，D5-AMOZ内标出峰时间在2.02 min，峰高最大值3.1 e5cps；呋喃西林出峰时间在3.67 min，峰高最大值1.6 e5cps，13C15N-SEM内标出峰时间在3.66 min，峰高最大值1.9 e5cps；呋喃妥因出峰时间在3.87 min，峰高最大值1.6 e5cps，13C3-AHD内标出峰时间在3.86 min，峰高最大值2.85 e5cps；呋喃唑酮出峰时间在4.65 min，峰高最大值1.3 e6cps，D4-AOZ内标出峰时间在4.60 min，峰高最大值2.1 e6cps。由此可见水产品中的基质对硝基呋喃类代谢物的检测并无干扰，出峰时间稳定峰型较为明显。

2.2 回收率试验 取上述阴性样品，分别加入标准溶液，使得四种硝基呋喃类代谢物理论上机浓度分别为1、5、10、15、20 μg/L，按照样品预处理方法进行处理，上机进样分析后，结果如表3，由此可见，经过多次实验表明，该改良版实验步骤，能够完全保证实验数据的有效可行性，回收率控制在90%～120%之间。

表3 各目标物加标回收率Tab 3 The recovery rate of four nitrofuran metabolites

2.3 精密度试验 取浓度为1 μg/L的基质标准溶液,重复进样3次，结果(表4)表明，四种硝基呋喃类代谢物3次相应的RSD值均<10%，精密度良好。

表4 检测方法精密度Tab 4 Precision of inspection method

2.4 实际样品测定 为验证方法的可靠性，从超市购买了多种类水产品(鱼片、河虾、明虾、螃蟹)，根据改进后的方法进行测定。多数阴性样品各离子谱图较为干净，没有检出。其中一明虾样品检出含有呋喃西林代谢物(SEM)，该样品在对应时间出峰明显(图9)，多次重复检测后判定其为阳性样品。

3 讨论与结论

在硝基呋喃类代谢物残留检测时，固相萃取方法在样品前处理的净化方面具有明显效果，可同时完成样品的提取与净化，大大提高检测灵敏度。华正罡[11]等采用超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中硝基呋喃类药物残留，对阴离子交换混合机理柱(MAX)和亲水-亲脂平衡料固相萃取柱(HLB)的净化效果进行考察，实验结果表明，在 pH 7.2～7.4时 HLB 固相萃取柱回收率最高。王娜[12]等在高效液相色谱与质谱联用法检测猪肉中四种硝基呋喃类代谢物中，衍生溶液用Oasis HLB固相萃取柱净化，甲醇洗脱，流动相定容，使用 Oasis HLB柱所得四硝基呋喃代谢物各自的平均回收率均在96.3% 以上。但是固相萃取方法也存在操作繁琐、费时较多、需要耗费大量的有机溶剂等缺点。GB/T 20752-2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定》[10]中采用Oasis HLB固相萃取柱净化，Oasis HLB 需要提前用甲醇和水活化，同时一定要保证柱体湿润。另外，固相萃取对畜肉、禽肉等动物组织具有较好的提取净化效果，但对基质比较复杂的水产样品(鱼、虾、蟹和贝类)，样品组织提取液呈黏稠、胶体状，则易产生堵塞、不宜洗脱。因此，采用GB/T 20752-2006的方法处理样品，效果并不好，因此，需要改进样品的提取净化方式。

图9 阳性样品SEM及其内标出峰谱图Fig 9 The mass-spectrogram of SEM and its internal-standard for of Positive Sample

刘四新[13]等研究液相色谱串联质谱法检测水产品硝基呋喃类代谢物，对现行GB/T 20752-2006中的前处理中的样品称取量、水解和衍生化、净化和定容试剂都进行了改进，其中在净化环节采用乙酸乙酯液液萃取，改进后方法的回收率为81.3%～106.0%，相对标准偏差小于11%。吴亚梅[14]等就农业部783号公告-1-2006(简称方法1)和GB/T 20752-2006(简称方法2)两种检测方法进行对比研究，结果发现方法1采用乙酸乙酯提取的前处理方法简单，检测信号干扰少，检出限、精密度和回收率优于方法 2，结果相对更准确可靠。在水产中硝基呋喃类代谢物检测时，样品经酸水解后衍生化，采用乙酸乙酯直接提取，氮吹后用流动相溶解残留物，然后上机检测。该方法操作简单，提取液易挥干(约20 min)，无需固相萃取特殊装置，成本较低，并且通过二级质谱的高选择性，可以进一步排除杂质的干扰，结果也比较稳定。

在本文研究中，以国家标准GB/T 20752-2006的实验方法为基础，对样品前处理过程进行了改进，样品衍生后采用乙酸乙酯直接提取，操作步骤简单方便。经过多次试验，证明改进后方法的结果及稳定性可靠，四种代谢物回收率控制在90%～120%以内，RSD<10%，能够达到标准要求的目标物检出限，可适用于日常水产品中硝基呋喃代谢物的大批量样品检测工作。