甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌对喹红霉素敏感性分析及其分子分型特点

黄 震， 胥志超， 张 波， 王红燕， 陈 重， 白 冰， 潘伟光， 李桂秋， 徐广健， 余治健， 邓启文， 李多云

(1. 深圳大学医学院附属南山医院感染科及内源性感染诊治研究重点实验室，广东 深圳 518052； 2. 深圳市宝安区人民医院肺科门诊,广东 深圳 518101； 3. 深圳市医院感染质量控制中心，广东 深圳 518052)

金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus，SA)是引起医院及社区感染的主要病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、心包炎和脑膜炎，甚至败血症、脓毒血症等全身感染[1-2]。目前的研究大多关注的是耐甲氧西林金黄色葡萄球(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)，然而，有相当一部分的感染是由甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptibleStaphylococcusaureus, MSSA)引起。在我国，MSSA 感染约占SA感染的40%，SA血流感染近一半由MSSA引起[3]，国外有研究[4-5]也发现， MSSA引起的血流感染正在增多或至少处于稳定状态。有报道[6]认为MSSA 携带的毒力因子编码基因如杀白细胞素、溶血素、中毒性休克毒素以及葡萄球菌肠毒素等的比例要明显高于MRSA。随着大环内酯类药物在临床上广泛使用，SA对大环内脂类-林可酰胺-链阳菌素B(macrolide-lincosamide-streptogramin B, MLSB)等耐药日益严重。为解决细菌耐药问题，SA对大环内酯类药物耐药的机制不断被阐明，第三代大环内酯类药物酮内酯类被开发出来。喹红霉素(ABT-773)作为第二个开发的酮内酯类药物，被认为疗效并不差于克拉霉素及泰利霉素。其抗菌机制主要为与23S rRNA上A2058位点及Ⅱ区A752及Ⅴ区U2609位点结合，阻止细菌肽链的延伸[7-8]。目前，在国内暂未发现喹红霉素用于抗SA的相关研究报道，而且，大多数的分子分型研究侧重于 MRSA，对于MSSA的分子流行特征所知有限。故本研究旨在了解临床分离的MSSA对喹红霉素体外敏感性，并与经典大环内酯类红霉素相比较，以探讨新型大环内酯类药物对MSSA抗菌效果的进展，进一步探讨MSSA不同多位点序列分型(MLST)的型别与喹红霉素对MSSA最低抑菌浓度(MIC)值之间的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 118株MSSA分离自深圳市南山医院2011—2015年住院患者送检的各种临床标本，标本来源为痰38株(32.2%)，咽拭子26株(22.0%)，其他呼吸道分泌物16株(13.6%)， 血15株(12.7%)，穿刺液10株(8.5%)、脓液9株(7.6%)和伤口分泌物4株(3.4%)。其中，呼吸道来源共80株(67.8%)。科室来源为ICU 19株(16.1%)、急诊观察室15株(12.7%)、呼吸科14株(11.9%)、儿科及新生儿科14株(11.9%)及其他科室56株(47.5%)。

1.2 菌株鉴定与药敏试验 所有菌株经VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统(法国梅里埃公司)鉴定为MSSA，采用美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法及K-B纸片法进一步测定所有药物MIC值，主要药物包括红霉素、喹红霉素、利福平、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、阿米卡星、万古霉素、利奈唑胺、呋喃妥因和替考拉宁，药敏纸片、药物和专用琼脂由英国OXOID公司提供，质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 25923。喹红霉素折点参考2016年CLSI M100-S26 标准推荐泰利霉素对SA的折点：敏感(≤1 μg/mL)，中介(2 μg/mL)，耐药(≥4 μg/mL)。耐药率=(中介株数+耐药株数)/检测株数×100%。

1.3 基因组DNA提取与纯化 采用四段划线方法分离MSSA， 选取单克隆菌株，经液体培养基增菌后离心，采用DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取试剂盒按照革兰阳性菌操作流程提取细菌基因组DNA，-20℃保存备用。

1.4 MLST 采用PCR的方法分别扩增MSSA菌株的7个管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqiL)，其引物、反应体系及反应条件参照MLST网站(http://Saureus.mlst.net/misc/info.asp)，目的基因402～516 bp，PCR产物纯化后进行测序，测序结果提交MLST网站(http://mlst.net)比对，与数据库中的SA相应基因的等位基因进行比较，获得每个管家基因的序号，然后按顺序依次排列，最终确定MSSA临床分离株的ST型。

1.5 统计学分析 应用软件SAS 9.4对数据进行统计分析，耐药率的比较采用χ2检验及Fisher确切概率法，P≤0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MSSA的耐药情况 118 株MSSA对喹红霉素MIC值跨度从≤0.03 μg/mL到>16 μg/mL，中介2株，耐药21株，耐药率达19.5%，对红霉素中介1株，耐药70株，耐药率高达60.2%，喹红霉素及红霉素对MSSA的MIC值分布见图1。通过Fisher确切概率法比较前二者MIC值分布，喹红霉素对MSSA效果均优于红霉素(P<0.001)。MSSA对利福平、环丙沙星及阿米卡星耐药率分别为3.4%、3.4%和1.7%；对利奈唑胺、万古霉素、呋喃妥因、替考拉宁及阿莫西林/克拉维酸均100%敏感。见表1。

图1 喹红霉素及红霉素对MSSA的MIC值分布

表1 临床分离MSSA菌株对常用抗菌药物的药敏情况

S：敏感；I：中介；R：耐药；MIC：最低抑菌浓度；MIC50/MIC90：分别为抑制50%和90%细菌生长时的最低药物浓度

2.2 MSSA的MLST与喹红霉素MIC值的关系 118株MSSA分为32个ST型，20株菌属于MLST数据库中未记载的新ST型(NT)。所有ST分型中无特别明显的优势菌株，数量位于前三的ST型分别为：ST7型15株(12.7%)， ST188型12株(10.2%)，ST59型12株(10.2%)。12株ST188型MSSA对喹红霉素均敏感，其余各不同ST型MSSA对喹红霉素MIC值分布见表2。

表2 喹红霉素对各ST型MSSA的MIC值分布

NT：新ST型； MIC：最低抑菌浓度；MIC50/90：分别为抑制50%和90%细菌生长时的最低药物浓度

3 讨论

SA是最常见的临床分离革兰阳性致病菌之一[2, 9]，该院SA主要来源于呼吸道标本，其次是血标本，科室集中在ICU和急诊观察室。由于大环内酯类药物同时对革兰阳性球菌和支原体、衣原体等病原体有广谱抗菌活性，故在临床上被广泛用于治疗呼吸道感染，但随之而来的是SA对MLSB耐药率持续上升。在本研究中，MSSA对常用的抗SA药物如阿莫西林/克拉维酸、呋喃妥因、万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁均100%敏感。对利福平、环丙沙星及阿米卡星亦高度敏感，仅少数菌株耐药。该院MSSA对红霉素耐药率达60.2%，稍高于徐修礼等[10]于2008年开展的大规模调查研究结果。本研究MSSA对喹红霉素耐药率为19.5%，MSSA对喹红霉素及红霉素的MIC值主要分布在≤0.25 μg/mL及>16 μg/mL组，呈两端分布，但喹红霉素对MSSA体外敏感性强于红霉素(P<0.001)。在国外相关研究[11]中，170株USA300克隆MRSA对喹红霉素均敏感，也反映了喹红霉素对SA的强效杀菌效果。SA对MLSB耐药主要是由于携带了甲基化酶基因erm及质粒介导的外排泵基因msr等[12]，但酮内酯类药物较MLSB类药物作用位点更多，并且SA的外排泵不能对喹红霉素进行排出[13]，从而可部分对抗MLSB类药物SA耐药问题。

经MLST发现，该院MSSA分为32个ST型，ST分型中并无特别明显的优势菌株，与Liu等[6]调查结果一致，主要的ST型分别为：ST7、ST188、ST59和ST398，说明临床分离的MSSA具有高度遗传多样性。在其他MSSA 流行病学研究报道中，主要流行型别因研究对象和地域的差异而呈现出差异性，其中 ST398、ST5、ST88、ST25、ST7和 ST188 等是中国较常见的流行型别[14-15]，而这些ST型别在该院均有发现。而SA的分子型别与其耐药表型有一定的相关性，如ST398、ST7、ST5、ST59等是主要的MSSA多重耐药克隆[16-17]，在本研究中，此4种型别对大环内酯类耐药率亦较高。ST188、ST30、ST72、ST88、ST1及ST15对喹红霉素均敏感，但由于其他型别样本量均较小，故不具代表性。喹红霉素对其余MLST型MSSA的MIC值分布无明显特点。

SA的耐药机制复杂，故本研究仍存在不足与局限性。首先，本研究未对更多的大环内酯类抗生素进行体外敏感性对比研究；其次，本研究未对MSSA中erm基因及msr基因分布进行进一步调查，MSSA对喹红霉素耐药机制有待进一步研究。再次，本研究样本量较小，对MSSA的种群进化进行研究需要多中心、长期的动态监测，才能为MSSA的防控提供更准确的参考依据。

综上所述，ST7、ST188、ST59和ST398是该院临床分离MSSA的主要MLST型别。我国MSSA菌株对大环内酯类抗生素耐药形势严峻，对SA的抗菌效果属于大环内酯类的“短板”，喹红霉素与常用于抗SA的其他抗菌药物相比并无明显优势，但较经典大环内酯类药物红霉素效果已有显著提升，故笔者相信，随着新一代大环内酯类药物的不断开发，终将能够达到理想的效果。本研究提示，ST型别与MSSA对喹红霉素MIC值分布之间无明显特点，但由于样本量较小，不一定具有代表性，有待更大样本量的研究进一步探讨。