2017—2018年江西地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子流行特征

曾 凌，邓 琼，刘 洋，张 杰，曾 婷，曹先伟

(1. 南昌大学第一附属医院医院感染管理科，江西 南昌 330006； 2. 南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006； 3. 南昌大学江西医学院，江西 南昌 330006)

耐药菌的出现与流行已成为全球一个不容忽视的严重公共卫生问题，越来越多的病原菌对常用抗菌药物产生耐药性，且耐药水平不断上升。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)临床分离率高，耐药谱广，可造成区域性暴发流行，治疗非常困难，导致患者住院时间明显延长，医药费用大幅度增加，病死率增高[1-2]。杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin,PVL)是坏死性细胞毒素，具有广泛的溶胞作用，除可促进脓肿形成外，还可引起严重甚至致命性肺炎[3]。不同地区的 MRSA 流行株呈现规律性分布，主要流行克隆株有一定的地区差异，且可随时间发生变迁，对当地分离菌株进行分子分型，了解菌株间的亲缘关系，明确当地流行克隆，对临床合理诊治感染，以及减少和控制耐药细菌的传播有重要意义。本研究采用分子分型技术，研究江西省MRSA的分子流行病学特点，揭示MRSA的遗传进化规律，并对PVL毒力基因进行检测，比较不同克隆间毒力因子的差异，探讨流行克隆可能的竞争优势，并为后续的机制研究提供资料。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2017年1月—2018年12月江西省11个城市11所医院临床MRSA菌株。所有标本均为无菌体液(血、尿、关节液、脑脊液、封闭的腹腔积液等)、高质量呼吸道标本(深部痰、支气管灌洗液等)，以及伤口分泌物等。为更好的体现MRSA感染的流行病学特征，仅纳入同一患者首次分离的菌株。所有菌株除采取常规手工鉴定以及全自动细菌鉴定系统VITEK 2 Compact进行鉴定外,同时经mecA+femB 双重 PCR 法双阳性者确认为 MRSA。

1.2 主要仪器与试剂 PCR仪(Bio-Rad)，VITEK浊度仪(BioMerieux)，脉冲场凝胶电泳仪(Bio-Rad)，EDTA(北京鼎国)，蛋白酶K(上海生工)，溶葡萄球菌酶(上海生工)，Sma I 限制性内切酶(Takara)，琼脂糖(Biowest)，Ex Taq DNA 聚合酶(Takara)。

1.3 引物设计与合成 spa分型、SCCmec分型、多位点序列分型(MLST)及PVL基因所使用的引物参照文献[4-5]设计，引物合成及扩增产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.4 方法

1.4.1 药敏试验 鉴定仪为法国VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏仪，釆用微量稀释法做体外药物敏感性试验，参照美国临床实验室标准化协会(M100-S27)规定的标准和EUCAST标准判断药物的敏感性。金黄色葡萄球菌ATCC 25923作为质控菌株。

1.4.2 spa分型 spa分型主要是基于spa基因X区重复序列的多态性,参照文献[6]，采用PCR方法扩增spa目标序列并测序，截取重复序列区域，登录官方网站(http://www.ridom.de/spaserver/)，得到该菌株的 spa 型别。

1.4.3 SCCmec分型 采用多重PCR方法[7]扩增SCCmec目标序列，在紫外凝胶成像仪下观察是否出现目的条带，依据条带位置确定分型。

1.4.4 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型和多位点序列分型(MLST) 综合应用PFGE和MLST对菌株进行同源性分析。 用SmaI(Bio-Rad Laboratories，CA，USA)消化整个染色体DNA，并在CHEF Mapper XA System中分离限制性片段。通过Dice相似系数和未加权配对组匹配算法(UPGMA)进行聚类分析，MLST是以7个管家基因(arcc、gmk、aroe、glp、pta、tpi、ygil)为基础进行型别分析。参照文献[8]，采用PCR方法扩增MLST的7对目标序列并测序，确认测序结果质量后将得到的结果序列提交至官方网站(http://www.mlst.net/)，确定每一株菌的等位基因谱，并得到该菌株的MLST型别。

1.5 数据分析 应用WHONET 5.6对数据进行分析。

2 结果

2.1 MRSA来源与分布 2017年1月—2018年12月江西省11所医院共收集临床分离MRSA 250株，经mecA+femB双重PCR扩增和综合药敏结果确认后，纳入本研究的MRSA 237株，其中，南昌32株，九江25株，景德镇19株，上饶40株，鹰潭27株，抚州21株，新余6株，宜春10株，萍乡17株，吉安20株，赣州20株。标本类型中，主要为分泌物，占31.22%(74株)，痰占29.11%(69株)，血占16.46%(39株)。见图1。

图1 江西省MRSA地区及标本来源分布

2.2 spa分型结果 对237株MRSA进行spa分型，共分为40个型别，发现新的spa基因型3株。其中主要型别为t437(74株，占31.22%)、t030(32株，占13.50%)、t114(20株，占8.44%)、t172(15株，占6.33%)、t441(14株，占5.91%)、t062(11株，占4.64%)。不同地区MRSA分离株的spa型别存在差异，除南昌地区以t030为主，其余地区均以t437为主，其他spa型别散在分布于各地区。

2.3 SCCmec基因分型结果 对237株MRSA分离株进行SCCmec基因分型，结果表明 SCCmecIVa为优势型别共158株，占66.67%；SCCmecⅢ共35株，占14.77%；SCCmecⅡ共32株，占13.50%；SCCmecⅴ共8株，占3.38%；未分型菌株4株。从各地区分布来看，南昌地区以SCCmecⅢ为主要型别，占59.38%(19/32)；其余各地区均以SCCmecIVa为主要优势型别。

2.4 PFGE分型和MLST结果 对237株MRSA进行PFGE分型，经聚类分析，结果为A～V 21个聚类组，从每一聚类组中抽取代表菌株进行MLST分析，优势型别为ST239、ST59、ST1和ST338克隆，分别占44.30%(105株)、32.07%(76株)、4.64%(11株)和2.53%(6株)，其他克隆型别散在分布，同时发现3株新的ST克隆型别。

通过eBURST软件聚类分析，21种不同型别的克隆分为9个克隆群(clonal complex,CC)。ST239属于CC239克隆群，是最优势的克隆群，占44.30%(105株)；ST59属于CC59克隆群，同时还包括ST1778、ST2207、ST338、ST545、ST925、ST3191克隆型，占42.19%(100株)；ST1属于CC1克隆群，同时还包括ST726和ST2125，占6.33%(15株)；ST4和ST45型同属于CC4克隆型，占1.69%(4株)；其余ST7、ST5、ST409、ST70、ST1232分别属于不同克隆群。见图2。

图2 21种ST型别的聚类分析(eBURST)

2.5 PVL毒力因子检测结果 237株MRSA中，检出PVL 32株,检出率为13.50%。地区分布显示，鹰潭地区PVL检出率最高，为29.63%，其次景德镇地区为26.32%，吉安地区为25.00%。分子分型显示，PVL阳性菌株中spa型别主要为t437型，占59.38%(19/32)，且19株t437型菌株SCCmec分型均为IVa，其中16株为ST59，江西地区PVL阳性菌株的主要型别为ST59-MRSA-IVa-t437型，见表1、2。

2.6 MRSA 分子特征 各种分型方法综合分析显示，ST59-MRSA-IVa-t437为江西地区的主要优势流行克隆型，且各地区之间存在一定程度的克隆播散。ST239-MRSA-Ⅲ-t030为次要优势流行克隆型，主要在南昌地区多见，其他地区散发，详见表3。

3 讨论

研究[9-10]表明，MRSA医院感染主要是由少数流行菌株引起，这些菌株一旦在医院定植，即可造成医院或地区，甚至不同国家之间的暴发流行。控制流行的重要策略在于明确流行环节，切断传播途径，终止耐药菌株在人群中的传播。因而，掌握分子特征对于鉴别菌株间的亲缘性，有效控制感染意义重大。为鉴别流行菌株，追踪传染源，国内外广泛采用的方法是对临床分离菌株进行分型研究，以确定菌株之间的同源性，从而为制定感染控制策略提供依据。

表1 各地区PVL毒力因子阳性情况

表2 32株PVL毒力基因阳性株各分型分布(株)

spa分型以spa基因的高变区X区为目标基因，具有分辨率高、分型能力强、检测速度快、结果命名标准化的优点，结果可相互比较，但对于极少数菌株分型可能有误差。SCCmec分型针对可移动元件分型，结果有国际标准，不同实验室的结果可进行比较。SCCmec分型的主要方法是多重PCR法或实时荧光定量PCR法，其中多重PCR因为无需特殊设备和相对较低的成本，应用更广，且对常见的SCCmec分型有较好的效果[10]。PFGE分型可较准确地分辨某地区某时期内流行菌株间同源性关系及各医院间相互传播情况，但不适用于长时间的全球流行病学监测。而MLST的应用很好地解决了此问题，其以7个管家基因(arcc、aroe、glp、gmk、pta、tpi、yqil)为基础，结果定义国际化，可相互比较，适用于宏观进化的研究，但此方法价格昂贵，分型能力稍低。此外，对特殊菌株可采取全基因组测序分型，进行全基因组比较，但此方法价格昂贵，技术要求高，分析比较复杂[11]。

表3 237株MRSA主要分子分型结果(株)

注：除CC239、CC59、CC1、CC4几个主要的克隆群外，其余ST7、ST5、ST409、ST70、ST1232分别属于不同克隆群。仅列出MRSA 的主要分子分型结果，一些散在的分型未列出

目前，全球MRSA主要流行克隆型包括ST239-Ⅲ型(巴西/匈牙利克隆)、ST247-IA(伊伯利亚克隆)、ST45-IV(柏林克隆)等[12-14]，亚洲地区MRSA流行趋势与其他地区不同，不同国家和地区之间差异也很大。如ST45-MRSA-IV克隆，也称为柏林流行株，常引起血流感染或呼吸道疾病病例暴发，而在中国大陆却少见报道。ST59-MRSA-IVa-t437为江西地区主要优势流行克隆型，且各地区之间存在一定程度的克隆播散。ST239-MRSA-Ⅲ-t030为次要优势流行克隆型，主要在南昌地区多见，其他地区散发，该结果与熊祝嘉等[9]对全国6个地区7所医院114株样本的分型结果基本相符。spa是金黄色葡萄球菌的重要毒力因子，能帮助细菌逃避宿主的免疫反应。2009发现spa-t030克隆成为优势克隆型别后，相关研究进一步发现ST239-MRSA-III-t030具特定耐药谱，且其生存能力更强[15]。但仍需要警惕ST59的克隆播散，ST59-t437克隆型别的MRSA比ST239-t030-MRSA更易导致基因结构的变化，降低药物敏感性[16]。同时ST59菌株在美国、新加坡、中国台湾地区及香港地区的CA-MRSA中广泛传播[17]。ST59-MRSA在中国的南方儿科患者中也普遍存在[18]，江西地区的流行克隆株，可能是中国香港、台湾地区传播至中国内陆地区所致[19]。而ST59一直被认为是中国地区CA-MRSA最常见克隆，加拿大的一项研究[20]显示，医院感染从2007—2011年短短5年CA-MRSA的比例翻了一倍。深圳市9所医院研究[7]显示，28.9%的HA-MRSA菌株是CC59-MRSA-IV/V-t437克隆，是典型的CA-MRSA的特征。亚洲各国面临同样处境，研究[14,20]显示，ST59-MRSA-IV-t437克隆在中国台湾地区以及韩国的医院均有报道。

不同国家、地区MRSA SCCmec优势型别也存在明显差异。亚洲地区，日本和韩国以SCCmec Ⅱ型为优势型别，我国香港和台湾地区均以SCCmec Ⅲ型为优势型别[21]。本研究结果表明，江西地区以SCCmecIVa为优势型别，占66.67%；SCCmecⅢ和SCCmecⅡ分别占15.19%、13.50%；从各地区分布来看，除南昌地区以SCCmec Ⅲ为主要型别外(占59.38%)，其余各地区都是以SCCmecIVa为主要优势型别。SCCmec Ⅲ型以HA-MRSA为主，SCCmecIVa以CA-MRSA为主，考虑南昌地区医院为省级医院，收治的患者多为各地区的重症患者，更易发生医院感染，而下级医院收治患者病情较轻，感染更多来自社区。CA-MRSA菌株中由于SCCmec元件相对较小，其负载的耐药基因较少，更有利于传播，造成大范围的流行。另外本研究未见 SCCmec I 型菌株，近年来也尚未见到相关研究报道，推测可能I型菌株为最早的流行菌株，流行时间长，已被Ⅱ、Ⅲ型菌株取代[22]。

本研究237株MRSA PVL阳性率为13.50%。研究[23]显示，携带PVL毒素的致病性金黄色葡萄球菌与皮肤及软组织感染、坏死性肺炎、坏死性筋膜炎等严重坏死性疾病密切相关，且致死率较高。2000年以前，未发现HA-MRSA中携带PVL，PVL曾被认为是CA-MRSA的特有生物学标记[24]。但近年研究发现，HA-MRSA中也可检出PVL基因，而CA-MRSA菌株也可不携带PVL基因[24-25]。本研究中PVL阳性株无明显CA-MRSA或HA-MRSA偏向，表明PVL并非是CA-MRSA的特有生物学标记，在HA-MRSA中PVL检出越来越常见，有产生高耐药、高毒力菌株的趋势，值得关注。从城市分布来看，鹰潭地区PVL阳性率最高，景德镇地区检出率次之，吉安地区检出率第三，呈现由东部向四周降低的趋势。因此，要加强对东部地区MRSA PVL阳性菌株的研究。

由此可见，不同型别的MRSA耐药情况和耐药机制并不完全一致，更加突出了对MRSA进行分子学分型的重要性，临床医生在选择抗菌药物时应注意不同型别菌株的耐药情况，在耐药率逐渐升高的情况下，有效控制患者病情显得尤为重要。本研究中，虽然选取了11个地级市11所三甲医院，尽量保证菌株的代表性与可比性，MRSA克隆分布的不均一性仍然存在一些不可控性，一方面可能与独特的地理位置密切相关；另一方面，不同城市的经济发展水平与医疗资源的配置也不同，而且流动人口也可能导致MRSA的克隆分布不均一。