不同产地黄芩种子质量差异及等级划分研究

(陕西师范大学西北濒危药材资源开发国家工程实验室，药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西 西安 710119)

优质的种子是实现中药材规范化生产的基础和首要条件，也是优质中药材生产的源头。但是，目前我国中药种子缺乏全面系统的质量标准。除了人参、三七、甘草等少数几种中药材种子建立了国家标准之外，很多中药材种子还处于无标准状态。近年来，随着中医药的不断发展，关于种子质量差异及等级划分标准的研究越来越多，如三七[1]、银柴胡[2]、蒙古黄芪[3]、秦艽[4]、王不留行[5]、续断[6]等。

中药黄芩的基源植物为唇形科植物黄芩(Scutellariabaicalensis)，以根入药，具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎的功效[7]。其发挥药效作用的化学成分主要是黄酮类成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌消炎等药理作用[8]。黄芩种子质量及其等级标准研究已有相关报道，孙志蓉等[9]通过测定黄芩质量评价指标和田间育苗试验对黄芩种子质量进行了研究，并按种子大小进行等级划分；王峰伟等[10]研究不同来源黄芩种子质量差异，并进行了质量评价指标的相关性分析；李云静等[11-12]以《农作物种子检验规程》为参照，建立了黄芩种子的质量检验方法，并基于多元统计分析方法，进行了黄芩种子质量分级方法的研究。但是，这些报道都以市场销售的黄芩种子为研究材料，对于在传统小农经济下的农户自采自种的种子质量研究还未见报道；而且不同的种子质量等级研究对于黄芩种子的质量等级划分存在不统一、不一致现象，难以对种子的质量进行有效的控制和评价。

本研究首次以农户家中实地收集到的10份不同产地的自种自采的黄芩种子为材料，通过测定黄芩种子的净度、含水量、千粒重、发芽率、生活力、发芽势等指标来评价不同来源黄芩种子的质量差异。并利用SPSS 25.0软件进行了相关性分析、主成分分析、系统聚类分析、K-均值聚类分析后，通过综合分析并结合实际生产情况，对所收集黄芩种子进行了质量等级划分，以期为后续黄芩种子质量评价及质量标准的制订提供参考。

1 材料与仪器试剂

1.1 供试材料

供试材料为2018年7—10月调研全国主要产区黄芩生产种植情况时收集的10份黄芩种子。经陕西师范大学植物学教研室鉴定为唇形科植物黄芩(Scutellariabaicalensis)的成熟种子。供试材料信息见表1。

表1 供试黄芩种子信息表

1.2 仪 器

人工气候箱(中仪国科(北京)科技有限公司)，WG-71电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，实验室PH计PE 20(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。

1.3 试 剂

纯净水(自制)，无水乙醇(天津市天士力化学试剂有限公司)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(北京酷来搏科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 扦 样

参照《农作物种子检验规程扦样》(GB/T 3543.2)的标准执行[13]。净度分析试验样品不少于2 500粒种子，送检样品量应不少于净度分析10倍量原则，确定净度分析的最小样品量不少于5 g。

2.2 净度分析

参照《农作物种子检验规程净度分析》(GB/T 3543.3)执行[13]。采用四分法分取试验样品，将扦样得到的种子，分别称取20 g。放置于干净白板，用镊子将净种子中的杂草种子、破碎干瘪种子、残留茎叶碎屑、细小石块等杂质选出。称重，重复3次。计算种子净度：

种子净度(%)=(净种子重量/样品重量)×100%。

2.3 水分测定

依照《农作物种子检验规程水分测定》(GB/T 3543.6)执行[13]。试验采用高温烘干法，在(135±1)℃高温条件下烘干4 h测定每批种子的含水量。按下式计算种子含水量:

种子含水量(%)=[(M2-M3)/(M2-M1)]×100%。

M1为样品盒质量，M2为样品盒及样品烘干前质量，M3为样品盒及样品烘干后质量。

2.4 重量测定[11]

将净度分析后的净种子均匀混合，采用“四分法”取样。从中随机抽取试验所需要的种子数目，分别用百粒法、五百粒法和千粒法3种不同方法测定每份样品的重量。其中百粒法和五百粒法重复3次，千粒法重复2次。分别计算平均值及变异系数。

2.5 种子生活力测定(TTC法)[14]

称取2.5 g TTC放入烧杯中，先加少许95%的乙醇溶解后，加蒸馏水后稀释定容至250 mL，再用1 mol·L-1的NaOH溶液调pH至7.0，配成1%TTC溶液，避光保存。对黄芩种子用水浸种24 h，挑选相对饱满健全的种子(每处理3次重复，每选取50粒)，除去种皮，将种仁放入装有1% TTC的染色器皿中，使染色液液面没过种子表面，在25 ℃条件下染色8 h。倒出TTC溶液，用清水将种子冲洗1～2次，观察种子染色情况。凡种胚全部或大部分被染成红色的即为具有生活力的种子，种胚不被染色的为失去生活力的种子。

2.6 发芽率(势)的测定

挑选饱满成熟种子放置铺有2层滤纸的培养皿中，在温度25 ℃、光照/黑暗12 h/12 h条件下测定发芽率(势)。每隔12 h记录发芽数。每次实验为100粒种子，每个产地重复3次。种子发芽以种子露出胚轴为准。

发芽率(%)=(11 d内种子发芽数/供试种子数)×100%；

发芽势(%)=(5 d内种子发芽数/供试种子数)×100%。

3 结果与分析

3.1 净度及含水量检验

从表2可以看出，陕西府谷的黄芩种子净度最高为95.60%，来自山西芮城的黄芩种子净度最低为69.10%，净度达到91.00%以上的黄芩种子有7份，占测试样品的70.00%。不同来源黄芩种子含水量差异明显，各批次种子含水量在5.63%～10.59%之间，平均含水量为7.90%。其中山西闻喜含水量最高，甘肃陇西含水量最低。说明农户对自种种子的净度处理比较随意，种子净度普遍偏低，种子干燥程度不一致，影响着后续黄芩种植的播种量以及长期保存。

表2 黄芩种子的净度及含水量分析(±s，n=3)

注：M1为样品盒质量，M2为样品盒及样品烘干前质量，M3为样品盒及样品烘干后质量；同列大写字母表示p<0.01水平下的差异显著性，同列小写字母表示p<0.05水平下的差异显著性。下同。

表3 黄芩种子千粒重的不同测定方法比较(±s，n=3)

表4 黄芩种子的发芽率、发芽势及生活力分析

3.2 千粒重检验

对不同来源的种子分别采用百粒法、五百粒法、千粒法测定黄芩的千粒重，分析结果见表3。通过方差分析，不同方法间无显著性差异(p>0.05)，并且变异系数均小于3%，测定值均有效。因此，这3种方法均可用于黄芩种子的重量测定。这与相关文献报道的五百粒法和千粒法可用于黄芩种子的重量测定，百粒法不适宜千粒重测定的结果不尽相同，有待进一步的研究[11]。不同来源黄芩种子间千粒重差异极显著(p<0.01)，千粒重最小为1.451 0 g，最大为1.941 8 g。其中，范围在1.50～1.80 g的种子占样品总量的60%，说明黄芩种子的千粒质量主要集中在此范围内。

3.3 发芽率、发芽势及生活力检验

不同来源黄芩种子发芽率、发芽势都存在极显著性差异(p<0.01)。由表4可知，山西阳城的发芽率最高，达到78.33%；山东莒县的发芽率最低，只有41.33%。平均发芽率为63.53%，低于平均发芽率的有5份，占到总数的50%，可见采集到的黄芩种子发芽率普遍偏低。各批次材料发芽势在39.67%～76.67%之间，不同试验种子间差异明显，平均发芽势为59.53%。笔者在实地取样过程中发现，不同产地存在黄芩种子播种量差异大、出苗不齐的现象，猜测可能与农户自收种子的发芽率(势)存在显著差异有关。各批次试验材料生活力在23.33%～94.66%之间，不同试验种子存在极显著差异(p<0.01)，其中，山东莒县的种子生活力最低，为23.33%，甘肃漳县次之，为54.00%。其余各批样品生活力均在70%以上，除山东莒县外，其余各批次平均生活力为79.92%。研究发现，农户自种自采的黄芩种子发芽率、发芽势以及生活力都普遍偏低，而且不同产地之间差异极显著。

表5 黄芩种子各指标测定结果均值(n=3)

3.4 测定指标汇总

黄芩种子测定指标数据平均值汇总，见表5。

4 黄芩种子质量分析与分级

4.1 相关性分析

相关性分析结果见表6，黄芩种子的净度和水分、千粒重、发芽率发芽势呈正相关关系，与生活力呈负相关关系，均没有达到显著水平；种子含水量与千粒重、发芽率、发芽势呈负相关关系，与生活力呈正相关关系，未达到显著水平；黄芩种子的千粒重与发芽率、生活力、发芽势呈负相关关系，未达到显著水平；黄芩种子发芽率与生活力呈显著正相关关系，相关系数达到0.764，与发芽势达到极显著正相关关系，相关系数为0.972；生活力与发芽势呈显著正相关关系，相关系数为0.652。

表6 黄芩种子质量分级标准指标相关性分析

注：*表示在0.05水平相关性显著，**表示在0.01水平相关性显著。

4.2 主成分分析及结果

主成分分析结果见表7，前3个特征值累积贡献率已达到90.587，说明前3个主成分基本包含了全部的指标信息。取前3个特征值，并计算出相应的特征向量。前3个主成分为：

F1=-0.152X1-0.158X2-0.265X3+0.331X4+0.319X5+0.325X6；

F2=0.498X1-0.548X2+0.522X3+0.348X4-0.325X5+0.376X6；

F3=0.879X1+0.796X2+0.144 5X3+0.991X4+0.431X5+0.621X6。

式中：X1为净度；X2为水分；X3为千粒重；X4为发芽率；X5为生活力；X6为发芽势。

综合来看，在第1主成分表达式中，发芽率X4、生活力X5、发芽势X6指标的系数较大，由4.1相关性分析得知，发芽率和发芽势呈极显著相关，可以将二者合并为一项即发芽率作为种子等级划分标准，又因第1主成分的方差贡献率最高，因此，本研究将发芽率和生活力作为黄芩种子分级的主要指标，千粒重和净度为参考指标。

表7 主成分方差贡献

4.3 系统聚类分析及结果

聚类分析结果见图1，10批种子在阈值为5处聚为3类。第一类群包括2(山西芮城)、3(山西夏县)、4(山西襄汾)、5(山西阳城)、7(陕西府谷)、8(甘肃陇西)6份材料，该类群具有发芽率高、生活力强的显著优势；第二类群包括6(山西闻喜)、9(甘肃漳县)、10(甘肃宕昌)3份材料，为中间类群；第三类群包括1(山东莒县)1份材料，该类群具有发芽率、生活力都最低。所以可以将黄芩种子分为即优、良和不合格3级。黄芩种子颜色有黑色和灰黑色的区别，但聚类结果发现，种子颜色与这4项评价黄芩质量的指标没有必然联系，可以认为黄芩种子质量与其颜色黑、灰黑无关。

图1 黄芩种子4项指标系统聚类分析

4.4 单项指标K-均值聚类分析

通过K-均值聚类分析，界定黄芩种子分级指标的范围，结果见表8。

表8 黄芩种子单项指标K-均值聚类分析结果

4.5 综合分析结果

通过黄芩种子测定指标的相关性分析和主成分分析，确定黄芩种子质量等级划分以发芽率和生活力为主要指标，千粒重和净度为参考指标。同时采用系统聚类分析对黄芩种子进行等级数的界定，K-均值聚类分析对黄芩种子分级指标界定。通过综合分析并结合实际生产情况，适当调整分级指标，初步制定黄芩种子质量等级划分标准，结果见表9。分级方法采用最低定级原则，即任何一项不符合规定标准都不能定为相应等级的合格种子。

表9 黄芩种子质量分级标准

5 讨 论

本研究发现，不同产地农户自种自采的黄芩种子质量普遍低下，且不同产地之间质量差异明显。不同来源的种子净度和含水量存在显著差异，反应了农户对自种种子含水量控制和净度处理比较随意，导致种子净度普遍偏低，种子干燥程度不一致，影响了种子寿命和播种量。笔者在实地取样过程中发现，不同产地存在黄芩种子播种量不一致、出苗不齐的现象，推测不同产地间黄芩种子净度、发芽率、发芽势及生活力存在极显著差异可能是导致上述现象的原因。研究发现，百粒法、五百粒法、千粒法3种方法均可用于黄芩种子千粒重的测定。不同来源黄芩种子千粒重存在极显著性差异，主要集中在1.50～1.80 g之间，千粒重的差异可能是黄芩不同种质所决定的。黄芩种子颜色有黑色和灰黑色之别，分析发现，种子颜色的不同与反应黄芩种子质量的相关指标之间并无质量优劣的联系，这与李小玲等[14]报道的黑色种子的质量显著高于灰黑的种子，而黑色并带有光泽的种子质量最好的观点并不一致。笔者认为，黄芩种子颜色的差异不一定是其成熟度不同造成的，也可能是黄芩不同种质之间存在的差别。

在黄芩种子等级划分过程中，利用统计软件对测定指标进行了相关性分析和主成分分析，确定以发芽率、生活力、千粒重和净度为分级指标。这与王峰伟等[10]、李云静等[12]、李小玲等[14]报道的质量划分标准的质量评价指标选择有契合之处，反映了选定这4个指标作为种子等级划分的合理性和普适性。本研究采用系统聚类分析进行等级数的界定，K-均值聚类分析进行分级指标范围的界定。结合实际生产情况，初步制定黄芩种子质量等级划分标准，该划分方法科学、严谨、合理，可以作为黄芩种子质量标准划分参考。在该标准下，10批样品种子质量为优的种子有3份，分别为山西襄汾、山西阳城、陕西府谷；质量为良的有4份，分别为山西芮城、山西闻喜、甘肃陇西、甘肃宕昌；不合格种子有3份，分别为山东莒县、山西夏县和甘肃漳县。按照李云静等[12]制定的黄芩种子质量标准，该10批样品中能达到一级的种子有4份，分别为山西襄汾、山西阳城、陕西府谷、甘肃陇西，其余均为二级种子。根据王峰伟等[10]制定的标准，没有任何样品种子能达到一级；二级种子有2份，分别为山西襄汾和陕西府谷；其余均为三级种子。李小玲等[14]以陕西商洛黄芩种子为材料建立了种子标准，在该标准下，收集到的10批样品种子均未达到一级；二级种子有2份，分别为山西襄汾和陕西府谷；其余均为三级种子。从上述对比来看，在不同的分级标准之下，收集到的黄芩种子划分的等级不一致，能够达到优质种子标准的很少。这既反映所收集到的农户自种自采种子质量低下的现状，也反映了目前黄芩种子质量缺乏统一性好、普适范围广、科学合理的等级划分标准。

优良的种子是提高药材产量、质量和高品质优质药材生产的前提。中药材质量的稳定需要种子生产的标准化，包括良种选育、生产储运、质量分级、检验规程等系列工程，其中首要任务就是种子质量标准的制定。本研究通过实地收集全国不同产地的黄芩种子，首次研究了不同产地农户自种自采的黄芩种子质量差异；利用统计分析方法结合实际农户生产情况，尝试制定了种子质量等级标准，为后续黄芩种子质量评价及质量标准的研究提供了一定的参考依据；同时，对比已有的黄芩种子质量标准研究，发现黄芩种子质量标准的研究还需进一步完善，相关工作有待进一步深入系统的研究。