附加秋水仙素培养基对烟草单倍体的加倍效应

卢小亮，张 强，孙 渭，吴洪启，李春莲，陈 鑫，齐宁海，陈耀锋

(1 西北农林科技大学 农学院，陕西 杨凌712100；2 中国烟草总公司 陕西省公司，陕西 西安710004)

建立作物重要特性的遗传分析群体并进行作物品种分子改良,是现代作物遗传育种工作的重要方面之一[1]。双单倍体(Doubled haploid，DH)群体作为重要的遗传分析群体之一，己经广泛应用于作物重要特性的遗传基础解析和遗传图谱构建等诸多研究领域[2]。利用花药培养诱导单倍体并进行染色体加倍,是DH群体构建及细胞工程育种的重要途径[3]。传统上单倍体的获得方法主要包括花药(花粉)离体培养[4]、未受精子房(胚珠)培养[5]和染色体消失法[6]等，其中花药离体培养诱导单倍体的应用最为广泛。

秋水仙素是一种常用的植物染色体加倍试剂[7]，其加倍处理方法主要包括实体人工加倍处理和离体培养加倍。从已有的报道来看，在实体人工加倍中，秋水仙素作用的主要对象是生长点，但其加倍几率很小，而且由此获得的加倍材料多为嵌合体，往往不能稳定遗传[8]。随着植物组织培养技术的发展，人们研究发现秋水仙素可以在离体条件下诱导单个细胞染色体加倍，从而克服了实体人工加倍处理方法的缺陷。目前，应用秋水仙素对烟草单倍体进行染色体加倍的方法较多，如浸花药法[9]、浸苗法[10]、胚状体处理法[11]、叶片再生法及浸腋芽法[12]等。尽管烟草是重要的模式植物，但因烟草单倍体加倍过程中受试验材料基因型和生长状况等的影响，加倍效率很不稳定，一般在10%～30%[13]，因此要获得大量加倍单倍体苗的DH群体仍存在一定难度。有研究表明，培养基附加秋水仙素对蝴蝶兰[14]和非洲菊[15]均有较好的加倍效果，但运用培养基附加秋水仙素进行烟草单倍体的染色体加倍尚鲜见报道。鉴于此，本试验以‘TMK-12’ב吉烟5号’和‘NC71’ב净叶黄’2个杂交组合烟草F1代花药培养获得的单倍体植株为材料，采用培养基附加秋水仙素的方法，研究秋水仙素处理时间和处理浓度对烟草单倍体加倍效果的影响，旨在探索秋水仙素在烟草单倍体染色体加倍应用中的新途径，为烟草重要特性遗传基础解析及分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

将供试杂交组合‘TMK-12’ב吉烟5号’和‘NC71’ב净叶黄’的F1代，种植于中国烟草总公司陕西省公司扶风科研基地，现蕾期摘取花萼和花冠等长的花蕾，置240 mL培养瓶于低温环境下带回实验室备用。秋水仙素为Sigma公司分析纯产品。

1.2 供试培养基

单倍体诱导培养基：Nitsch H+体积分数15%椰子乳+0.1 mg/L IAA+0.1 mg/L 6-BA+30 g/L 蔗糖+6 g/L琼脂，pH 5.6。单倍体生长培养基：1/2 MS+0.5 mg/L IAA+20 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂，pH 5.8。单倍体加倍培养基：1/2 MS+0.5 mg/L IAA+20 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂+秋水仙素，pH 5.8，其中秋水仙素质量分数设为0.02%，0.05%和0.10% 3个水平。

1.3 试验方法

1.3.1 烟草单倍体诱导 取供试材料F1植株的花蕾置培养瓶内于4 ℃低温处理48 h后，用体积分数75%酒精漂洗15 s，用1 g/L的HgCl2消毒8～10 min，无菌水清洗3次，然后用无菌镊子小心剥出花药组织接种到烟草单倍体诱导培养基上，置(28±1) ℃暗培养40～45 d后，转至(28±1) ℃、3 000～4 000 lx、16 h/d光照条件下培养3周，即获无菌单倍体幼苗[16]。

1.3.2 烟草单倍体染色体加倍 以单倍体生长培养基为基础培养基(作为对照)，在基础培养基中分别添加0.02%，0.05%和0.10%秋水仙素制成单倍体加倍培养基，然后将生长至1～2 cm高的烟草无菌单倍体幼苗转入单倍体加倍培养基，于(25±2) ℃、3 000～4 000 lx、16 h/d光照条件下培养1，4和7 d后，将无菌苗直接转入单倍体生长培养基中进行壮苗和生根。每个处理6个培养瓶，每瓶接种5株烟草单倍体幼苗，3次重复。于(25±2) ℃、3 000～4 000 lx、16 h/d光照条件下继续培养50 d，统计加倍处理后烟草幼苗的存活数，计算存活率：存活率=存活幼苗数/处理幼苗数×100%。

1.3.3 烟草染色体加倍幼苗的鉴定 待转入单倍体生长培养基的烟草幼苗生长至6片真叶时，以未经秋水仙素处理的单倍体植株为对照，采用流式细胞仪检测法(Attune®N×T声波聚焦流式细胞仪)[17]和气孔保卫细胞叶绿体计数法[18]对各处理存活植株进行染色体倍性鉴定，统计加倍幼苗数，计算染色体加倍率。染色体加倍率=加倍染色体幼苗数/处理幼苗数×100%。

1.3.4 烟草DH群体构建 将经流式细胞仪检测法和气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定为双单倍体的烟草植株，移栽到20 cm口径的双色花盆中，于(27±2) ℃、8 000～10 000 lx、16 h/d光照条件下培养，直至收获种子。

1.4 数据处理

利用Microsoft Excel 2010和DPS 17.10软件对试验数据进行处理，采用Duncan新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 烟草单倍体的获得

烟草单倍体的诱导结果如图1所示，接种到烟草单倍体诱导培养基的花药在(28±1) ℃下暗培养40～45 d后，花药组织变为褐色并开裂产生大量白色胚状体，随后转至(28±1) ℃、3 000～4 000 lx、16 h/d光照条件下培养3周，白色胚状体大量萌发，形成单倍体小苗，然后转入单倍体生长培养基使单倍体幼苗生根、复壮，即可获得大量健壮的烟草单倍体幼苗。

A.新接种的花药；B.花药开裂并产生大量白色胚状体；C.胚状体萌发形成大量小苗；D.健壮的烟草单倍体幼苗

2.2 秋水仙素对烟草单倍体幼苗生长的影响

秋水仙素质量分数和处理时间对烟草幼苗生长的影响结果见图2和图3。

烟草植株加倍处理后转入单倍体生长培养基培养50 dAfter the tobacco plants were doubled,they were transferred to haploid growth medium for 50 days

A.TMK-12×吉烟5号；B.NC71×净叶黄;不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。下同

由图2可以看出，随秋水仙素处理时间的延长，0.02%秋水仙素处理使烟草幼苗逐渐变黄，而0.10%秋水仙素处理对烟草幼苗存在严重毒害作用，甚至导致幼苗死亡。由图3可以看出，随着秋水仙素处理时间的延长，烟草单倍体幼苗存活率总体呈下降趋势，在秋水仙素质量分数为0.02%，0.05%和0.10%时，处理1 d后‘TMK-12’ב吉烟5号’和‘NC71’ב净叶黄’杂交组合F1单倍体幼苗的存活率分别为70.67%，72.78%，66.89%和76.89%，72.78%，73.44%，当处理时间增至7 d时，存活率显著降低，分别为63.31%，25.72%，6.56%和60.33%，47.20%，32.71%。综合比较，经0.02%秋水仙素处理1，4和7 d及0.05%,0.10%秋水仙素处理1和4 d后的存活率均在50.00%以上。

2.3 秋水仙素对烟草单倍体加倍效果的影响

通过流式细胞仪检测法和气孔保卫细胞叶绿体计数法对各处理烟草幼苗存活植株进行染色体倍性鉴定，结果见图4。由图4可以看出，0.02%秋水仙素处理烟草单倍体的加倍率随处理时间延长呈先上升后下降的趋势；0.05%和0.10%秋水仙素处理烟草单倍体的加倍率随处理时间延长均呈下降趋势。综合比较，‘TMK-12’ב吉烟5号’和‘NC71’ב净叶黄’2个杂交组合F1单倍体幼苗在0.02%秋水仙素处理4 d时染色体加倍率均达最高，分别为50.60%和39.83%，随后染色体加倍率随秋水仙素质量分数的增大和处理时间的延长而降低。

A.TMK-12×吉烟5号；B.NC71×净叶黄

3 讨 论

秋水仙素是植物染色体加倍的常用试剂，其原理是在细胞有丝分裂期间通过抑制或麻醉纺锤体的形成而实现染色体的加倍[19]。刘仁祥等[13]的研究表明，在一定秋水仙素浓度范围内，染色体加倍率随着秋水仙素浓度的增加而增加。但秋水仙素是一种剧毒物质，浓度过高会对植株造成严重的毒害作用，抑制甚至损害植物的生长和发育。因此，选用合理的秋水仙素处理水平及处理时间是染色体成功加倍的关键。对于不同作物，秋水仙素的处理水平和时间有一定差异。张天翔等[20]采用浸泡法和培养基添加法处理芦笋单倍体茎尖，发现以培养基添加0.03%秋水仙素处理7 d的加倍效果最好；单芹丽等[15]比较了培养基添加秋水仙素法、全株浸泡法和茎尖浸泡法对非洲菊单倍体植株的加倍效果，结果表明以培养基添加0.05%秋水仙素处理非洲菊单倍体植株4 d时的加倍效果较好。本试验结果表明，附加0.02%秋水仙素培养基处理烟草单倍体幼苗4 d时染色体加倍效果最佳。造成这种差异的原因可能是不同作物的外植体对秋水仙素的耐受力和反应不同，但具体原因有待进一步探究。

在本试验中，秋水仙素的质量分数和处理时间对烟草幼苗的存活率和染色体加倍率均有显著影响，且秋水仙素处理时间对烟草幼苗存活率、染色体加倍率的影响要大于秋水仙素质量分数的影响，这与刘仁祥等[21]的研究结果一致。本试验采用相同的秋水仙素处理方法对2个杂交组合的单倍体幼苗进行加倍处理，结果表明，随秋水仙素质量分数和处理时间的变化，‘TMK-12’ב吉烟5号’和‘NC71’ב净叶黄’2种供试材料染色体加倍率的变化幅度表现出较大差异，这与李涵等[22]对非洲菊的研究结论类似。造成这种差异的原因可能与供试材料的基因型以及幼苗的生理状态、生长状况有关。

目前，在烟草单倍体染色体加倍应用中以浸花药法、浸苗法、叶片再生法及浸腋芽法为主，其中前两种方法的加倍率较高，但同时产生畸形苗的频率也较高，浸腋芽法加倍率较低，叶片再生法的加倍操作程序繁琐，限制了秋水仙素在染色体加倍中的应用。本研究采用培养基附加秋水仙素的方法研究了秋水仙素对2种烟草单倍体的加倍效果，结果表明经0.02%秋水仙素处理4 d时，烟草单倍体幼苗存活率为66.56%～76.56%，同时染色体加倍率高达39.83%～50.60%。究其原因可能在于所使用的秋水仙素质量分数较低，未对烟草单倍体幼苗造成最直接的毒害作用，从而提高了存活率；其次加倍处理在培养基中完成，单倍体幼苗不会因缺氧而死亡；第三是将烟草单倍体幼苗切口直接插入加倍培养基，这在一定程度上更有利于单倍体植株较为缓和地吸收秋水仙素，从而达到染色体加倍的目的，但具体原因仍有待进一步深入探究。

4 结 论

发育到单核靠边期的烟草花药组织在单倍体诱导培养基上可诱导出大量的胚状体，并在强光照条件下进一步发育为烟草单倍体幼苗；‘TMK-12’ב吉烟5号’和‘NC71’ב净叶黄’2个杂交组合F1单倍体幼苗在附加0.02%秋水仙素的培养基中处理4 d时，加倍率最高可达50.60%和39.83%；利用这一技术体系，成功建立了2个杂交组合分别含61和68个加倍单倍体株的DH群体。