塔罗科血橙采后花色苷合成规律、挥发性物质组分及含量变化分析

冯桂蓉，王小容，谢姣，邓丽莉,3，明建,3，曾凯芳,3，姚世响,3*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)2(国家级食品科学与工程实验教学示范中心(西南大学)，重庆，400715)3(西南大学，食品贮藏与物流研究中心，重庆，400715)

血橙属甜橙类，也是柑橘中唯一能以花色苷着色的种类，果肉呈红色血丝或血斑状[1]。塔罗科血橙(Tarocco)最早由意大利引入，是中国血橙的主要品种[2]，在重庆、湖北、湖南等地均有栽种。血橙果肉色泽独特，玫瑰香气浓郁，甜度高，品质优良。血橙富含β-胡萝卜素、花色苷、Vc及类黄酮等多酚类，大量矿质元素钾、钙、镁，微量矿质元素铁、铜、锌、锰、镍等。花色苷具有多种生理活性，包括抗氧化活性、降血压、抗癌和增强免疫力等[3-4]。花色苷由花青素和糖酯化生成，是花青素生理状态下的存在形式。采前果实成熟度和光照、土壤及气候等环境因素[5]，采后温度及贮藏时间都与花色苷合成密切相关。采后低温贮藏对血橙花色苷合成有明显的诱导效果，含量可提高10倍以上[6-7]。

花色苷合成通过苯丙烷代谢途径，即以苯丙氨酸为合成前体，经一系列酶催化合成花色苷。关键酶主要有苯丙氨酸裂解酶(phenylalaninammo-nialyase，PAL)、查耳酮合成酶(chalcone synthase，CHS)、二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)及尿苷二磷酸葡萄糖-类黄酮葡萄糖基转移酶(UDP-glucose3-O-flavonoid glucosyltransferase，UFGT)等[8]。柑橘的香气成分主要有萜烯类、醇类、酯类、醛类和酮类化合物，其中萜烯类所占比例最大[9]。萜烯类物质可由甲羟戊酸(mevalonate pathway，MVA)和2-C-甲基-D赤藓糖醇-4-磷酸(methyl-erythritol-4-phosphate pathway，MEP)两条途径合成，底物是丙酮酸和3-磷酸甘油醛[10-11]。血橙的食用口感上似乎血丝较多的果实香气更为浓郁，但从生物合成途径来看，花色苷和挥发性化合物合成的前体都是糖酵解产物，两种物质合成过程是否呈现此消彼长的竞争关系值得探索。本研究以塔罗科血橙为材料，用固相微萃取法(solid phase micro extraction,SPME)和气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析挥发性物质组分及含量在无血和有血果实中的差异，为采后血橙品质保持提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

塔罗科血橙于2018年1月采于重庆江津果园。挑选大小、形状、果皮颜色相近、表面无伤的果实，使用保鲜剂(2，4-二氯苯氧乙酸)稀释后浸泡30 s，晾干后用PE塑料薄膜袋包装，置于低温通风库保藏(8～10 ℃，80%～85%RH)。正己烷(色谱纯)，天津四友；色谱纯癸酸乙酯(纯度≥95%)，阿达玛斯试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PAL-1型手持数显糖度计，日本Atago公司；20 mL顶空样品瓶，杭州微米派科技公司；QP2010PLUS气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；DB-5MS气相色谱柱，安捷伦公司；DVB/CAR/PDMS 50/30 μm固相微萃取头，美国Supelco公司；VIS-722型可见分光光度计，上海精密科学仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 观察血橙血丝形成过程及可溶性固形物含量测定

每周选取20个果实对血橙的血丝形成状态进行剖面观察。

可溶性固形物(total soluble solids,TSS)测定：将果实纵切分为4等份，对每一等份横切5等分，对果蒂、赤道部位和果顶的果肉用手持数显糖度计测定，每部分3次重复，实验进行5个生物学重复(果实)，每周测定1次。

1.3.2 总花色苷含量测定

参照喻最新[12]实验方法测定血橙花色苷含量。将果肉用榨汁机混匀、过滤、然后离心10 min(10 000 r/min)。取2 mL上清液和8 mL缓冲液A(0.05 mol/L KCl、0.15 mol/L HCl，pH 1.0)混合，取2 mL上清液与8 mL缓冲液B(0.4 mol/L CH3COONa、0.24 mol/L HCl，pH 4.5)混合，分别在510和700 nm处测定吸光值，3个生物学重复。花色苷含量计算如公式(1)所示：

(1)

式中：ε=24 825，表示矢车菊素-3-葡萄糖苷在pH 1.0缓冲液中510 nm下的摩尔吸光系数；MW=484.82，表示矢车菊素-3-葡萄糖苷分子量；DF=5，表示本次的稀释倍数；L=1，表示本次的光程，cm。

1.3.3 感官评价设计

参照曹琦[13]方法进行感官实验。选择培养12名感官评价员，对有血和无血两种果肉的6种感官特性进行评价，包括橘子香气、果肉饱满度、甜味、酸味、橘子风味、喜爱度。每种样品重复3次，评分标准见表1。

表1 感官评价评分标准Table 1 Sensory evaluation criteria

续表1

序号果实性质性质描述评分标准/分3甜味有明显甜味,令人愉悦甜味稍淡感知不到甜味7～94～61～34酸味有明显的酸味酸味较淡,但能感知到感知不到酸味7～94～61～35橘子风味入口后橘子味道浓郁入口后橘子味道不是特别浓郁,且有其他味道入口后橘子味道寡淡,几乎无味7～94～61～36喜爱度酸甜合适,无其他不良味道稍微偏酸或者甜酸味道较为寡淡非常酸或几乎没有甜酸味,甚至有异味7～94～61～3

1.3.4 GC-MS分析

挑选表面饱满无伤果实，分别选取有血与无血果肉，使用榨汁机破碎并混匀。准确称量3.0 g果肉匀浆样品置于顶空样品瓶中。用50 mL正己烷稀释10 μL葵酸乙酯(内标)后，取10 μL加入已加样品的萃取瓶中，立即密封瓶口，用萃取头在40 ℃恒温水浴萃取40 min。

GC-MS条件：色谱柱为DB-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm ID，0.25 μm)；升温程序：40 ℃保持1 min，以3 ℃/min升至50 ℃，保持1 min，再2 ℃/min升至70 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至220 ℃，保持2 min；载气(He)流速4.6 mL/min；压力33.8 kPa；进样口温度250 ℃；不分流进样。离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；扫描范围m/z30～400。

定性及半定量分析：血橙果肉的挥发性物质经过GC-MS分析鉴定后，以图谱库NIST 08和NIST 08S为标准图谱库，检索结果与之对照。采用内标法做定量分析。

1.3.5 数据处理与分析

所得数据使用Origin 8.0，Excel 2010，GraphPad Prism 5绘制相关图表，统计学判断方法使用t检验及单因素方差分析(P<0.05具有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异)。

2 结果与分析

2.1 血橙血丝形成规律

刚采摘的血橙几乎没有血丝，随着贮藏期的延长血丝逐渐形成，最终布满整个果实(图1)。大多数果实经2周贮藏后仍处于无血状态(图1-A)；果实贮藏至第4周，果顶部位逐渐出现少量血丝(图1-B)。第5周(图1-C)和第6周(图1-D)血橙处于快速上血阶段，红色呈丝状还没有形成斑块，主要分布在果顶部位较多，且靠近果皮、心部位。第7周血丝逐渐延伸到赤道，并呈血斑状态(图1-E)，随着贮藏期的延长血斑愈发明显。而贮藏后期，血丝逐步在果蒂部位形成贮藏，第16周大部分血橙果肉呈完全着色状态(图1-F)。有研究表明，花色苷含量可能在采后低温冷藏下急剧增加[14]，塔罗科血橙在8 ℃下贮藏85 d，花色苷含量达到高峰[15]。从本研究结果推测，花色苷在低温贮藏下快速积累、含量增加，与前人报道相似。

图1 塔罗科血橙采后花色苷积累过程Fig.1 Postharvest accumulation of anthocyanins in Tarocoo orange fruits注：A为第2周；B为第4周；C为第5周；D为第6周；E为第7周；F为第16周。

2.2 血橙可溶性固形物分布规律

如图2所示，整个贮藏期的果实TSS含量始终呈现出果蒂(上)<赤道(中)<果顶(下)的规律。在1～5周，果实的TSS含量逐渐增加。在第5～6周时含量显著上升，并在第6周达到了最大值：上部为11.2%，中部为12.0%，下部为13.3%，此时果蒂与赤道差异最小。在第7周含量发生陡降，第8周后同一部位含量差异不大，整体含量呈现缓慢下降的趋势。果实在采后贮藏中要进行正常呼吸作用，需要依靠对糖的消耗分解，故而呈现出TSS含量采后初期少量增加而后整体下降趋势[16]。

图2 塔罗科血橙贮藏过程中TSS含量变化Fig.2 Distribution pattern of TSS in Tarocoo orange fruits during postharvest storage

2.3 总花色苷含量测定及果实感官评价

如图3所示，花色苷是花青素经酶催化，与糖结合而成的甙类物质，与血橙颜色密切相关，是评价果实品质的重要指标。测定结果显示，花色苷含量显著影响血橙果肉颜色。有血血橙果肉花色苷含量为(90.26±5.23)mg/mL，无血血橙果肉为(5.14±0.12)mg/mL。有血血橙花色苷含量是无血果肉的17.5倍，差异极显著(P<0.01)。有研究发现，塔罗科血橙在低温贮藏70 d后，果汁的花色苷含量从7.11 mg/mL上升至54.44 mg/mL[17]，变化显著。在本次实验中选取含有明显血斑的果肉部分，故而花色苷含量更为丰富。

图3 两种塔罗科血橙的花色苷总含量Fig.3 Total anthocyanins contents of two types of Tarocoo orange fruits during postharvest storage

如图4所示，有血血橙的各项感官评分均比无血血橙高，其中两者汁胞饱满度均达到了7.5 分，说明果肉新鲜，符合感官评价的设计原则。而两种果肉的酸味均在4.8 分左右，没有明显差异。有血与无血血橙的橘子香气分别为(5.00±0.75)分、(6.58±0.66)分，两者的橘子香气差异具备统计学意义(P<0.05)。无血血橙的橘子风味为(5.67±0.49)分，有血为(7.17±0.93)分，呈极显著性差异(P<0.01)。甜味性质两者间呈极显著差异(P<0.01)，有血比无血血橙平均评分高近2分。由感官评价结果得出，随着血橙花色苷合成，较之无血果肉其感官性质如香气、风味、甜味都有一定程度的提高，在喜爱度的评分中也存在极显著性差异，一定程度上说明花色苷的积累提高了血橙感官品质。

图4 两种塔罗科血橙果实的感官评价Fig.4 Sensory analysis of two types of Tarocoo orange fruits注：*表示两者具有显著性差异，P<0.05;**表示极显著性差异，P<0.01。

2.4 花色苷合成对挥发性物质组分及含量的影响

萜烯类、醛、醇、酯和酮类等化合物是柑橘的主要香气成分，萜烯类所占比重最大。以单萜、倍半萜及衍生物为主，萜烯类如D-柠檬烯，α-蒎烯、α-异松油烯、香叶烯,其衍生物如芳樟醇、4-松油醇等[18-19]。其中萜烯类如月桂烯、(E)-罗勒烯、β-古巴烯、其衍生物如紫苏醇、紫苏醛、反式芳樟醇氧化物、顺式芳樟醇氧化物被认为是甜橙的特征香气成分[20]。但目前对于有血与无血血橙挥发性成分的测定并未发现有相关报道。本实验鉴定出无血血橙中含有12种挥发性成分，有血血橙含有13种，单萜和倍半萜化合物均占据了主要地位。两者间的种类差异不大，几乎都是共有的。其香气成分主要有D-柠檬烯，β-月桂烯、β-水芹烯、氧化石竹烯等，其他挥发性物质含量较少。在无血与有血两种状态下，果肉挥发性物质的总离子流图见图5，挥发性物质组分及相对含量见表2。

A-有血血橙；B-无血血橙图5 塔罗科血橙果肉挥发性物质的总离子流色谱图Fig.5 Total ion chromatogram of volatiles of Tarocoo orange flesh

表2 两种血橙果肉的挥发性物质组分比较Table 2 Comparison of volatile constituents between two types of Tarocoo orange flesh

注：字母相同表示两者无显著性差异，不同表示有显著性差异。

在本次实验中发现，花色苷合成对血橙挥发性物质有一定改变作用。就组分而言，花色苷合成前后果实所含的单萜和倍半萜类组分差异不大，但含量具有差异。萜烯类化合物中丰度最高的是单萜D-柠檬烯，在花色苷合成后含量显著增加(P<0.05)。另随着花色苷合成，含量上升的有Elixene、α-芹子烯、β-倍半水芹烯、葎草烯、β-芹子烯、β-律草烯、α-人参烯、氧化石竹烯，且差异显著(P<0.05)。β-月桂烯在无血果肉中更多，但差异并无显著性；两者间的香叶基丙酮的比值达到了262.5%，具有统计学差异(P<0.05)。ARENA等[21]探究得出塔罗科血橙的香气成分主要为柠檬烯、α-蒎烯、β-月桂烯及丁酸乙酯、己酸乙酯、丁酸甲酯、己醛等，与摩罗血橙、华盛顿脐橙、瓦伦西亚晚橙相比，塔罗科血橙以α-蒎烯、β-月桂烯及己醛、辛酸乙酯等为特征香气成分。乔宇等[22]并未检测到丁酸甲酯，而检测到了芳樟醇。在此次实验中，辛酸乙酯仅出现在有血果肉中，芳樟醇则特异性地存在于无血果肉中，推测花色苷合成与挥发性物质变化具有一定联系。但挥发性物质的这种差异也有可能是因为血橙品种不同，栽培条件、生长因素及后续的贮藏过程及样品的处理检测方法，检验设备并不完全相同所致。

3 结论与讨论

部分柑橘种类中果实可溶性固形物呈现梯度分布[23-24]，最近发现这种梯度分布可能是柑橘果实的普遍现象[25]，可溶性固形物浓度从果蒂至果顶方向逐渐升高[26]。本研究首次发现血橙可溶性固形物也呈类似的梯度分布。可溶性固形物含量在贮藏第6周达到顶峰，花色苷也在第6周快速合成，具有较强的相关性；可溶性固形物含量最高的部位是果顶处，同时也是花色苷合成的起始部位。前人研究显示糖是诱导花色苷合成的信号分子，在黄连木叶片[27]、紫叶稠李叶片[28]、草莓[29]及苹果[30]等中也出现了类似的现象。花色苷合成所需的碳骨架由糖通过糖酵解途径提供，可溶性糖为花色苷合成提供前体物质，因此其含量增加对花色苷积累具有促进作用[31]。

本次研究发现花色苷合成并不会降低挥发性物质的含量，即并不抑制挥发性物质的合成。实验结果显示：花色苷合成后，有血血橙的花色苷含量显著高于无血血橙，但挥发性物质组分几乎没有变化，大部分组分的含量却上升。感官评定结果也显示有血血橙香气更为浓郁，受喜爱程度更高。柑橘果实主要的香气成分为萜烯类物质，经由氧化作用从糖生成丙酮酸再到乙酰辅酶A，为萜烯类化合物的两种合成途径供给原料。花色苷合成与糖类物质含量有关，而糖是挥发性物质的前体物质，由此推测两种化合物在复杂的生物合成途径存在着某种关联作用。因此基于本研究结果分析，糖作为挥发性物质和花色苷的合成原料，它起到的促进作用掩盖了挥发性物质和花色苷在生物合成途径上可能存在的竞争关系，致使花色苷合成对挥发性物质含量没有造成影响。