基于柑橘汁多甲氧基黄酮特征成分鉴别橙汁中宽皮桔汁

周琦，谈安群，易鑫，李贵节,3*，程玉娇，谭祥，ROUSEFF RUSSELL LEE ，吴厚玖，翟雨淋，廖洪波，王华*

1(西南大学柑桔研究所，中国农业科学院柑桔研究所，重庆，400712)2(国家柑桔工程技术研究中心，重庆，400712)3(重庆市功能性食品协同创新中心，重庆，400067)4(西南大学 植物保护学院，重庆，400715)5(重庆市质量和标准化研究院，重庆，400023)

橙汁因其酸甜可口的风味和丰富的营养价值而广受消费者喜爱。截止2017年，我国柑橘汁的出口量和出口金额分别达4 740.64 t和1 080.75万美元，其中橙汁出口占75%以上[1]。随着消费者权利意识的增长，全球消费者普遍对橙汁原料标签的真实性较为关注。相关国际组织已出台相应法律法规予以规范，如国际食品法典委员会在法典247—2005中规定甜橙汁中允许掺入少量其他柑橘汁以调配其色泽、口感和风味，但其量不得超过橙汁可溶性固形物总量的10%，并需予以明确标注[2]；然而我国尚未对调配橙汁允许掺入的比例做出明确规定。过度调配会降低橙汁的品质，影响消费者的购买体验，损害消费者的利益。除此之外，还有少数不良商家将廉价的果渣提取液与橙汁按照一定比例混合来充当100%天然橙汁，或用质量低劣的果实原料冒充品质上乘的甜橙果实，甚至掺水稀释、再利用甜味色素回味补色谎称纯品橙汁。

常规的品质鉴别手段主要是国标法，其规定了橙汁及橙汁饮料相应的感官要求和理化指标，并公布了不同种类橙汁各组分(可溶性固形物、钾、总磷、氨基酸态氮、L-脯氨酸、总D-异柠檬酸和总黄酮)含量的标准值和权值。但这种方法需要测定的组分种类繁多、分析复杂、可变性因素大且引入的误差也较大[3]。基于此，国内外研究者开发了色谱-质谱串联检测等新型鉴别方法对橙汁的品质进行识别[3-6]。BOCHAROVA等[7]利用气相色谱-质谱联用和稀释法对橙汁中的风味物质进行了分析比较，建立了工业橙汁稀释指标与鲜榨橙汁稀释指标的比较评价数据库，有助于对鲜榨橙汁的品质进行快速鉴别；CUEVAS等[8]采用高效液相色谱-高分辨率质谱(high performance liquid chromatography -high resolution mass spectrometry,HPLC-HR-MS)和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)对商品橙汁的代谢组学指纹图谱和醛类、酯类等挥发性成分进行分析，建立了可选类别模型，初步实现了对有机橙汁和传统橙汁的鉴别。此外，张淼等[9]利用电子舌对含不同比例的橙汁饮料的鲜榨橙汁进行口味识别，发现随着掺入比例的提高，样品分布呈现一定的规律性，证明了电子舌技术能够有效地用于橙汁真实性的鉴别中；刘伟红等[10]采取改良十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)对果汁中DNA进行提取，利用UGT基因引物对柑橘属植物进行特异性扩增，证明了UGT基因特征性引物可用于橙汁的鉴伪研究中。目前橙汁品质鉴定的研究方向已经聚焦于柑橘汁中特征性数据库的建立[11]，但该方法需依托质谱等昂贵仪器，鉴别成本高且耗时长。

多甲氧基黄酮(polymethoxyflavones,PMFs)是柑橘中特有的一类黄酮类物质，其分子含有多个甲氧基，极性较低，具有抗炎、抗氧化、抗突变、抗癌等生物活性[12-15]。近几年，国内外研究者开发了多种测定柑橘汁中黄酮的方法[16-17]。已有研究表明甜橙和宽皮柑橘中的PMFs种类与含量具有一定的区别[18]，因此通过分析两者之间的差异或成为鉴别橙汁中是否含有宽皮柑橘汁的可能途径。本研究通过常规HPLC检测，利用主成分分析(principal component analysis,PCA)建立常见甜橙汁与宽皮柑橘汁中的多甲氧基黄酮的鉴别模型，对掺入宽皮柑橘汁的橙汁样品进行识别，以期橙汁品质的鉴别提供一种简便、高效、低成本的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

成熟甜橙果实和宽皮柑橘果实，采自丰都、忠县、江津等柑橘园和西南大学柑桔研究所国家果树种植柑橘资源圃。

1.1.2 试剂与耗材

甲醇、乙腈、四氢呋喃(tetrahydrofuran,THF)为色谱纯，美国Honeywell公司；乙酸乙酯、磷酸为分析纯，成都市科隆化学品有限公司。

标准物质：异甜橙黄酮、四甲氧基异野黄芩素、四甲氧基野黄芩素、七甲氧基黄酮、5-脱甲基川陈皮素，上海源叶生物公司；甜橙黄酮、川陈皮素，加拿大TRC；桔皮素，美国ChromaDex；以上标准物质纯度均≥98%。

Sep-Pak Plus C18固相萃取柱，美国沃特世公司；0.22 μm有机相针式滤器，上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

1260型高效液相色谱系统(配备二极管阵列检测器和荧光检测器)，安捷伦科技有限公司；Sorvall ST 16R高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技有限公司；SB-5200 DTN超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；DouR@SPT-H型氮空吹扫浓缩仪，北京斯珀特科技有限公司；VacMaster负压固相萃取系统，瑞典Biotage公司；H-100-DWBWIA01原汁机，惠人新生活文化传媒有限公司；SQP十万分之一天平，赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理及样品制备

采摘新鲜成熟的果实，去皮榨汁，经过100目纱网过滤后装瓶备用。吸取12 mL摇匀的果汁，在4 ℃以13 400×g离心10 min，分别收集上清液和沉淀。

上清液萃取：参考LI等[19]的方法，稍作修改。固相萃取柱依次通过5 mL甲醇和5 mL蒸馏水，使填料活化和平衡，然后将果汁样品上清液缓慢通过萃取柱，再用28%乙腈水溶液除去酚酸、黄烷酮类和类胡萝卜素等杂质，最后用乙酸乙酯洗脱收集。洗脱液用N2流在40 ℃下吹干，用1 mL甲醇复溶，通过有机相针式滤膜过滤，注入液相色谱自动进样瓶备用。

果肉沉淀萃取：参照DUGO等[20]萃取柑橘中氧杂环成分的方法，加入乙腈旋涡振荡30 s，然后室温超声(P=300 W)5 min，吸取上清液，以上操作重复3次。合并收集的萃取液，用N2流吹干后再用1 mL甲醇复溶，通过有机相针式滤膜，注入自动进样瓶备用。

1.3.2 液相色谱条件

色谱柱为安捷伦Poroshell 120 EC-C8柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)，并配备相同型号的填料保护柱；流动相流速为1 mL/min，梯度见表1；二极管阵列检测器(DAD)波长扫描范围为210～550 nm，荧光检测器(FLD)激发波长扫描范围为250～400 nm，发射波长扫描范围为360～550 nm；柱温30 ℃，进样量5.0 μL。

表1 流动相梯度 单位：%Table 1 Mobile phase gradient

注：A-0.025%磷酸水溶液；B-甲醇；C-乙腈；D-THF/A=1∶4。

1.3.3 样品多甲氧基黄酮的定性与定量分析

样品中目标PMFs的定性检测通过紫外吸收光谱、荧光发射光谱和保留时间三者结合来进行判定[21]。样品PMFs定量检测采用外标法，UV定量波长为330 nm，数据采用Microsoft Excel 365处理分析。

2 结果与分析

2.1 多甲氧基黄酮的分离和检测

PMFs混标的UV和FL信号的色谱图如图1所示。由图可知，8种目标PMFs分离度良好，均在23 min后出峰；前端留空，该部分是果汁经SPE处理后未除尽的少量酚酸、黄烷酮及香豆素等干扰物，留空有效避免了干扰物与目标PMFs共流出。各物质的外标定量工作曲线和线性关系见表2，线性关系良好(R2≥0.998)。

图1 多甲氧基黄酮混合标准品液相色谱图Fig.1 HPLC Chromatogram of polymethoxyflavone mixed standards

表2 多甲氧基黄酮标准品紫外吸收定量回归方程Table 2 Regression equation of ultraviolet absorption for polymethoxyflavone standard substances

2.2 两类果汁中PMFs的分布特点及含量

以长叶香橙和椪柑为例，典型的甜橙汁与宽皮柑橘汁中多甲氧基黄酮的色谱图如图2所示。8种PMFs在两类果汁中都有分布且川陈皮素(4)峰面积均为最大。除川陈皮素外，甜橙汁中甜橙黄酮(2)所占比例最高，四甲氧基野黄芩素(5)、七甲氧基黄酮(6)含量次之，而宽皮柑橘汁中桔皮素(7)所占比例最高，其他PMFs含量较低。该分布情况与DUGO[20]的测定结果相类似。

常见品种的甜橙和宽皮柑橘果汁中PMFs的含量分别如表3和表4所示。甜橙汁中异甜橙黄酮(1)的含量最高为0.222 mg/mL(渝早橙)，而宽皮柑橘汁中异甜橙黄酮含量最低为0.31 mg/mL(2003-4号)，最高可达1.357 mg/mL(丽红)，可见宽皮柑橘汁中异甜橙黄酮含量均高于甜橙汁。此外，宽皮柑橘汁中四甲氧基异野黄芩素(3)、川陈皮素(4)和桔皮素(7)的含量也普遍高于甜橙汁，而甜橙黄酮(2)的含量则相反。

2.3 样品PMFs的主成分分析

将22个甜橙和28个宽皮柑橘共计50个果汁样品以8个多甲氧基黄酮为变量进行主成分分析，其中样品数远大于变量数，结果如图3和图4所示。

表3 22个常见甜橙汁样品的多甲氧基黄酮含量Table 3 Content of polymethoxyflavones in 22 samples of typical sweet orange juices

注：结果采用平均数±标准差显示，保留小数点后3位，单位mg/mL；ND为未检出。

表4 28个常见宽皮柑橘汁样品的多甲氧基黄酮的含量Table 4 Content of polymethoxyflavones in 28 samples of typical mandarin juices

注：宽皮柑橘均采于中柑所，结果采用平均数±标准差显示，保留小数点后3位，单位mg/ml；ND为未检出。

图3 甜橙汁与宽皮柑橘汁主成分分值图Fig.3 Score plotting of principal components analysis in sweet orange juice and mandarin orange juice注：左图中三角形符号代表甜橙样品，圆点符号代表宽皮柑橘样品；右图1～8为标准物质序号

图4 柑橘汁样品Hotelling’s T2检验结果及主成分累积可释方差Fig.4 Hotelling's T test results and cumulative interpretable variance of the principal components of orange juice samples

由图3的二维分值图(上)可见，甜橙汁样品点与宽皮柑橘汁样品点分别汇聚，2个集合间差异明显；由相关性载荷图(下)可见，四甲氧基野黄芩素(5)和甜橙黄酮(2)在PC-1上的相关度分量达到0.8～0.9，而川陈皮素(4)、5-脱甲基川陈皮素(8)、异甜橙黄酮(1)、四甲氧基异野黄芩素(3)和桔皮素(7)在PC-2上的相关度分量在0.8～1.0之间，即2组PMFs分别在Y+和X+方向上有较大贡献；分值图和载荷图的空间关系相对应。由上述结果可知，PMFs在甜橙汁和宽皮柑橘汁中的分布具有特征性组合，能够通过PCA对两类果汁进行区分；而在两类样品集合之间的样品点则同时具有甜橙和宽皮柑橘的PMFs组合特征。由图4可知，Hotelling’sT2检验仅有少数离群点，PC-1和PC-2对总方差的贡献度达到81%，检验曲线与标准曲线无较大差异，说明模型能够很好的反映原始样本的特征。

2.4 甜橙汁中掺入宽皮柑橘汁的鉴别

利用2.3所得判别模型对掺入宽皮柑橘汁的甜橙汁进行鉴别验证。在市场上购买价格低廉的椪柑与高品质、高售价的长叶香橙，分别榨汁后，按5∶95、10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65的体积比例混合，每个调配比例进行3次平行试验。按照1.3.1前处理方法和1.3.2液相色谱法测定多甲氧基黄酮种类及含量，将各组调配果汁样品的PMFs含量平均值数据代入PCA判别空间中进行鉴别。由图5可知，含有5%椪柑汁的样品接近甜橙汁类群的边界；随着掺入比例的升高，调配橙汁样品点越来越接近并深入宽皮柑橘汁类群，其中含10%椪柑汁的样品已明显脱离甜橙汁范围，而趋近于宽皮柑橘汁边界。由此可直观地将掺入比例≥10%的调配橙汁予以鉴别，从而判定产品是否符合国际食品法典委员会的规定。同理也可判断其他常见品种宽皮柑橘汁和橙汁的调配样品。需特别说明，某些甜橙和宽皮柑橘杂交品种(即杂柑，如：不知火橘橙、莫科特橘橙和清见橘橙等)的多甲氧基黄酮分布特征介于两者之间，它们在上述判别空间中的分值点可能会落在甜橙和宽皮柑橘集合之间，但由于这些杂柑鲜食口感较好，鲜果售价高，所以其果汁被误判为超量调配橙汁的现实可能性几乎不存在。

图5 不同比例宽皮柑橘汁掺入甜橙汁的判别Fig.5 Discrimination of sweet orange juice mixed with different proportion of mandarin orange juice

3 结论

采用C18固相萃取和乙腈分别对柑橘汁上清液和果肉微粒进行充分萃取和浓缩，利用高效液相色谱法测定了甜橙汁与宽皮柑橘汁中8种目标多甲氧基黄酮的含量；通过主成分分析建立了掺入宽皮柑橘汁的调配甜橙汁的鉴别模型。将椪柑汁以不同体积比例掺入长叶香橙汁中进行鉴别试验，结果显示鉴别模型能够对含体积分数10%及其以上椪柑汁的调配橙汁实现有效判别。该方法简便易行，对仪器设备要求较低，可适用于甜橙汁中是否掺入过量的宽皮柑橘汁。