益气活血方对慢性心力衰竭大鼠心肌IP3R mRNA、mi-CK mRNA表达水平的影响

朱 波 杨 艳 苏仁意 许细平 孙乾朕 阙新祥

（1.湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院，湖北 襄阳 441000；2.长江大学仙桃临床医学院，湖北 仙桃 433000）

慢性心力衰竭（CHF）是各种心血管系统疾病发展的终末期表现，其发生过程有各种因素参与，临床表现复杂，预后较差，对人们生命健康造成了严重的威胁［1-2］。相关文献报道，益气活血方药具有益气活血、温阳利水的作用，而且能改善血流动力学指标和心肌能量代谢，增强心肌收缩力和改善心功能［3-4］。心肌线粒体肌酸激酶（mi-CK）是磷酸肌酸激酶（CK）同工酶家族成员，与三磷酸腺苷（ATP）再生有关。三磷酸肌醇受体（IP3R）能与内质网重要的伴侣蛋白Sigma-1受体（Sigma-1R）相互作用从而调控心血管系统功能。为此，本研究建立心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，探讨该方抗心力衰竭的机制，为临床治疗提供依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年健康Wistar大鼠90只，雄性，12周龄，体质量（210±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0001，1周适应性喂养，自由饮水。

1.2 实验药物 益气活血复方提取浸膏干粉（黄芪、丹参、人参、益母草、三七粉、茯苓、葶苈子，此组方每克干粉相当于生药2.86 g），襄阳市第一人民医院提供。赖诺普利片由国药集团汕头金石制药有限公司生产，每片5 mg；国药准字：H20065767。

1.3 试剂及仪器 mi-CK免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；羊抗兔IgG、mi-CK抗体（北京中杉生物技术有限公司）；基因扩增仪Gene Amp PCR system 9700（美国应用生物系统公司）；SONOS5500彩色多普勒超声机（美国安捷伦科技有限公司）；BS-51显微镜（日本Olympus公司）。引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 模型制备 采用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.5～0.8 mL/100 g），大鼠背位固定，经喉气管插管术，连接呼吸机，以50～55次/min，潮气量0.7～0.8 mL进行人工呼吸。在左胸第3～4肋间横向切开皮肤，长度大概1.5 cm，钝性分离肌层，接着沿3～4肋间隙打开胸腔，暴露心脏，撕开心包，轻提左心耳，在动脉左主干起源点2～4 mm处用6号缝线结扎（正常组只穿线，不结扎），随后立即重置心脏于胸腔，逐层缝合。术后连续7 d注射青霉素钠，预防感染，常规饲养。术后第5周行EF检测，心电图显示左室射血分数EF值≤40%则表示心衰造模成功。

1.5 分组与给药 剔除死亡以及不符合心衰标准的大鼠。造模成功的大鼠随机分为模型组、西药组、中药组，未左冠脉结扎手术只穿线的假手术大鼠纳入正常组。每组各15只大鼠。术后第5周正常组及模型组灌服等容积蒸馏水，每日1次。根据换算公式，给药剂量（g/kg）=人的剂量（g）×0.018/所求动物体质量（kg）。中药组予以4.6 g生药量（kg·d）的益气活血方药物；西药组予以1.5 mg生药（kg·d）的赖诺普利片，各组连续给药4周。

1.6 标本采集与检测 1）血流动力学检测。将连续给药（蒸馏水）结束后的大鼠，以10%水合氯醛0.5～0.8 mL/100 g腹腔麻醉，背位固定于鼠板，应用心脏Doppler检测左室压力变化最大速率（±dp/dtmax）。2）心肌组织IP3R mRNA、mi-CK mRNA的检测。处死大鼠，取心脏心肌组织，分成2份，装入冻存管，并于液氮中冷冻后，-80℃冰箱保存，待测。采用实时定量荧光PCR法检测IP3R mRNA、mi-CK mRNA表达：取出标本后，用Trizol法提取总RNA，计算总RNA的浓度和纯度。取2 μg总RNA，按照说明书配制20 μL反应体系，进行反转录。PCR扩增IP3R、mi-CK，并扩增β-actin。以cDNA为模板，扩增出208 bp的DNA序列。IP3R的序列如下。上游引物：5′CATTTGCCGACTCTGCTACA3′。下游引物：5′TGTGCTTTTCCAGGAGCT TT3′。mi-CK的序列：上游引物：5′AGATGCCAGTAA AATCCGTTCTG3′。下游引物：5′TTCGGCCAGTTCTGACTCTAGAG3′。内参对照物β-actin的序列：上游引物：5′AGATCCTGACCGAGCGTGGC3′。下游引物：5′CCAGGGAGGAAGAGGATGCG3′。扩增条件为：95 ℃10 min预变性，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，40个循环。灌制琼脂糖凝胶，取10 μL PCR产物进行电泳鉴定。紫外分光光度计检测，应用凝胶扫描成像系统分析PCR产物条带。

1.7 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两两比较用LSD法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组左室压力变化最大速率比较 见表1。本次研究结果中，与正常组比较，各治疗组±dp/dtmax明显升高，模型组明显下降（P＜0.05）；与各治疗组比较，模型组±dp/dtmax明显下降（P＜0.05）；与西药组比较，中药组±dp/dtmax明显升高（P＜0.05）。

图1 IP3R、mi-CK、β-actin扩增片段电泳图

2.2 各组IP3R mRNA、mi-CK mRNA水平比较 见表2。如表2所示，与正常组比较，中药组和模型组IP3RmRNA表达明显增加，模型组mi-CK mRNA表达明显降低（P＜0.05），正常组与西药组在IP3R mRNA、mi-CK mRNA表达上比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与各治疗组比较，模型组IP3R mRNA表达明显增加，mi-CK mRNA表达下降（P＜0.05）；与西药组比较，中药组IP3R mRNA表达明显增加（P＜0.05）；西药组mi-CK mRNA表达高于中药组，但比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组左室压力变化最大速率比较（mmHg/s，±s）

表1 各组左室压力变化最大速率比较（mmHg/s，±s）

与正常组比较，∗P＜0.05；与各治疗组比较，△P＜0.05；与西药组比较，#P＜0.05。下同

-dp/dtmax 4908.63±100.71*#4716.41±109.24*5024.11±108.723101.54±116.18△组别中药组西药组正常组模型组n 15151515+dp/dtmax 5643.19±195.13*#5212.67±171.07*4816.63±160.323256.22±180.54*△

表2 各组IP3R mRNA、mi-CK mRNA水平比较（2-△△Ct，±s）

表2 各组IP3R mRNA、mi-CK mRNA水平比较（2-△△Ct，±s）

组别n IP3R mRNA mi-CK mRNA 15151515中药组西药组正常组模型组1.15±0.13*#1.03±0.071.02±0.141.52±0.47*△1.69±0.991.71±0.781.90±0.981.29±0.69*△

3 讨论

本次实验采用冠脉结扎法制备心衰大鼠模型，模拟临床上较为常见的缺血性心衰，是目前成熟且公认的心衰模型，与心肌梗死所致的心力衰竭的病理生理变化相似。并且针对气虚血瘀这一病机，选用中药益气活血复方灌胃，方中黄芪可补气固表，托毒排脓；丹参具有活血祛瘀，通经止痛的作用；人参有补脾益肺、生津之功效；益母草可活血调经、清热解毒；三七粉止血、散瘀；茯苓健脾、宁心；葶苈子具有利水消肿、泄热逐邪的作用，诸药共奏益气活血、通络化瘀之效［5-6］。近年来研究发现，益气活血方药能够抑制或逆转心室重构，缓解心力衰竭。本研究结果显示，模型组±dp/dtmax明显低于正常组，说明模型组大鼠心功能下降，符合心衰症状。经治疗，各药物组±dp/dtmax明显高于模型组，提示应用药物后，西药及益气活血中药都能够延缓心功能转向失代偿期的进程，减轻心功能恶化。与西药组比较，中药组±dp/dtmax明显升高，提示益气活血方具有增强心肌收缩力的作用。

心脏主要由大量的ATP维持收缩功能以及磷酸肌酸（PCr）储备能量［7-8］。然而ATP本身含量相对少，CK作为肌酸激酶能量穿梭系统的关键酶，其穿梭系统调控ATP与PCr间的能量转换［9-10］。当发生CHF，会损伤肌酸激酶穿梭系统功能，mi-CK与CK受抑，影响ATP转运穿梭效率，进而使得心肌收缩功能障碍。本研究结果显示，模型组心衰大鼠心肌mi-CK mRNA明显低于正常组。经治疗，各用药组大鼠mi-CK mRNA及蛋白有所上升，且明显高于模型组，但西药组与中药组比较差异无统计学意义，说明中西医治疗均可以上调mi-CK mRNA水平，改善ATP转运穿梭效率，增加细胞内能量流，增强心肌收缩力，减缓心衰恶化的进程。

相关文献认为，IP3R与Sigma-1R相互作用会对Ca2+-ATP酶活性造成间接影响［11-13］。在Sigma-1R抑制剂的作用下，会削弱Sigma-1R与IP3R形成复合体，抑制Ca2+从内质网向线粒体转运，而且诱导内质网内Ca2+释放至胞质，以至于减少线粒体ATP，造成心功能恶化［14-15］。本研究结果显示，与正常组比较，中药组和模型组IP3R mRNA表达明显增加；与各治疗组比较，模型组mi-CK mRNA表达下降，比较差异具有统计学意义；与西药组比较，中药组IP3R mRNA表达明显增加，比较差异具有统计学意义。结果说明益气活血方可能通过抑制IP3R mRNA，进一步调控内质网及线粒体间Ca2+信号转导改善亚细胞器损伤，改善心肌能量代谢。考虑到亚细胞器间信号转导结构较为复杂，关于IP3R在保护心肌细胞上的作用仍需进一步探讨其分子机制，为治疗CHF提供科学依据。

综上所述，益气活血复方可降低心衰大鼠心肌IP3R mRNA表达，增加mi-CK mRNA表达，改善亚细胞器损伤和ATP转运穿梭效率，改善心肌的舒缩功能，减缓心衰恶化的进程。