中药逐水饮对小鼠Lewis肺癌胸腔积液模型积液生成及Th17免疫平衡的影响∗

刘晓芳 金昌凤 魏一强 赵 静 孙素芹 高 磊 李义君

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150036；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150000）

恶性胸腔积液（MPE）约占全部胸腔积液的38%～53%，其中约40%MPE是由肺癌、淋巴癌、乳腺癌等恶性肿瘤胸膜转移引起，是肿瘤扩散或病情进展至晚期的常见并发症之一，临床MPE的发生往往预示预后不良［1-2］。大量胸腔积液可造成患者胸闷、胸痛、呼吸困难、气促等症状，严重者可危及生命，因此积极有效地控制MPE对改善肿瘤患者临床症状，提高生存质量，延长生存期十分重要。目前，MPE治疗方法较多，但采用手术等方法会引起晚期及老年患者不能耐受，且短期内复发率仍然很高，同时化疗药物毒副作用也较大［3-4］。中医药可通过作用于MPE形成的多个环节抑制MPE形成，具有一定安全性和治疗疗效，是近年来临床治疗恶性肿瘤并发症的手段之一［5］。中药逐水饮由党参、黄芪、白术、葶苈子等药物组成，具有泻肺利水、消除积液、益气健脾等作用。本研究体外建立小鼠Lewis肺癌胸腔积液模型，观察中药逐水饮对小鼠MPE生成及Th17细胞免疫平衡的影响，探讨其治疗MPE的可能作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性C57BL/6小鼠，70只，SPF级，12周龄，体质量15～25 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（黑）20160013。

1.2 试药与仪器 1）试药：中药逐水饮，组成：黄芪20 g，人参15 g，葶苈子20 g，瓜蒌皮20 g，大枣15 g，桑白皮15 g，百部15 g，苦参20 g，莪术15 g，白花蛇舌草20 g，夏枯草10 g，甘草15 g。水煎煮2次，浓缩配制为生药含量1g/mL药液。小鼠Lewis肺癌瘤株，上海研生实业有限公司提供。胎牛血清，HyClone公司，批号20170619；生药含量1 g/mL DMEM培养基，HyClone公司，批号20170619；RPMI1640培养基，上海玉博生物科技有限公司，批号20170725；台盼蓝染色液，北京索莱宝科技有限公司，货号C0040；顺铂注射液，规格：每支10 mg，齐鲁制药有限公司，批号20160309；FIcoll分离液，北京索莱宝科技有限公司，批号20170309；枸橼酸钠，南京化学试剂有限公司，批号080560059；佛波酯，北京索莱宝科技有限公司，货号P6741；离子霉素，美国Sigma公司，批号I-0634；FITC标记的CD4抗体（批号20170503）、PE标记的RORγτ抗体（T17）（批号20170416）、Alexa647标记的Foxp3抗体（Treg）（批号20170328）购于北京奥维亚生物技术有限公司；白细胞介素17（IL-17）（批号ab83708）、白细胞介素23（IL-23）（批号ab23305）、转化生长因子β1（TGF-β1）（批号ab86349）试剂盒购于Abcam公司。2）仪器：HH-6数显恒温水浴锅，上海析达仪器有限公司；RCO3000TVBA CO2培养箱，REVCO公司；DYS-107三目生物显微镜，上海点应光学仪器有限公司；MS-TS精密天平，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；FACSCalibur流式细胞仪，BD公司。

1.3 细胞传代及Lewis肺癌单细胞悬液制备 取小鼠Lewis肺癌瘤株，快速放入37℃水浴锅中复温，转移至新的无菌离心管中，轻轻吸打使细胞均匀分散，800 r/min离心5 min，弃上清，加入适量含有10%胎牛血清的新鲜DMEM培养基，重悬，制成细胞悬液。取细胞悬液加入250 mL培养瓶中，放入培养箱培养，待细胞80%～90%融合时进行传代，3～4 d传代1次。取第3代细胞，接种于小鼠腋背部皮下。取接种10～14 d的小鼠，处死，剥离肿瘤组织，取生长良好的瘤组织，用生理盐水反复冲洗后，用无菌玻璃杵子将瘤块碾碎成单细胞悬液，经150目筛网过滤后，将细胞悬液转移至无菌离心管中，1500 r/min离心5 min，弃上清，使用0.9%氯化钠溶液洗涤2次。加入0.9%氯化钠溶液重悬细胞，台盼蓝染色检测活性细胞＞90%，调整细胞浓度为2×106个/mL。

1.4 动物分组及小鼠Lewis肺癌胸腔积液模型建立70只小鼠去除胸前毛发，75%乙醇常规消毒，随机选取56只小鼠经胸前皮下短时间内注射0.2 mL上述细胞悬液建立Lewis肺癌胸腔积液模型，给药1次［6］。造模成功后，随机分为模型组、逐水饮组、顺铂组、逐水饮+顺铂组，每组14只。另取14只小鼠皮下短时间内注射0.2 mL 0.9%氯化钠溶液作为正常对照，给药1次。

1.5 干预方法 正常对照组正常喂养，不做任何处理。Lewis肺癌胸腔积液模型小鼠建模后第3日起开始给药。模型组正常喂养，不给予任何药物。逐水饮组：参考范一平等方法［7］，将27 g/（kg·d）生药药液调整至0.2 mL给予小鼠灌胃，每日1次。顺铂组：将顺铂注射液用9 L 0.9%氯化钠注射液稀释后，以6 mg/（kg·d）胸腔灌注，隔3日1次。逐水饮+顺铂组：27 g/（kg·d）生药药液，调整至0.2 mL给予小鼠灌胃，每日1次，同时给予胸腔灌注顺铂6 mg/（kg·d），隔3日1次。各组连续给药10 d。

1.6 样本采集 于建模后第14日行胸部CT检查，观察胸腔积液生成情况。给药结束后（即建模后第14日），每组取8只小鼠处死。眼球取血，一部分1 mL血样，经2000 r/min离心后收集血清-80℃保存；另一部分1 mL血样，以体积比1∶1加入PBS溶液稀释，使用FIcoll分离液分离单个核细胞。同时收集MPE，测量MPE体积。取适量MPE，离心后，弃上清，加入PBS溶液重悬，使用FIcoll分离液分离单个核细胞；另取适量MPE，以体积比9∶1加入3.8%枸橼酸钠抗凝，离心取上清保存。每组剩余6只小鼠用于观察生存率。

1.7 观察项目 1）胸壁转移瘤计数、转移瘤质量：由两位经验丰富的医师，在解剖显微镜下计数前、侧、后胸壁转移瘤个数，然后剥离胸壁转移瘤，称质量。2）流式细胞术检测MPE及外周血中Th17、Treg细胞百分比：离心收集MPE单个核细胞和外周血单个核细胞，加入RPMI1640培养基重悬，调整细胞浓度为2×106个/mL，分别加入2 μL佛波酯和伊屋诺霉素混合液、1 μL离子霉素混匀，置于37℃，5%CO2培养箱中培养4 h。取200 μL细胞悬液，加入FITC标记的CD4抗体、PE标记的RORγτ抗体（Th17）、Alexa647标记的Foxp3抗体（Treg）及其相应同型抗体，4℃避光染色30 min。使用含2%胎牛血清的PBS溶液洗涤1次，然后加入200 μL PBS溶液重悬，并转移至流式检测管。使用FACSCalibur流式细胞仪（BD公司）检测各种荧光素强度，Flow-Jo7.6.5软件分析Th17细胞和Treg细胞占CD4+T细胞的百分比。3）MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子水平：取血清和MPE上清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血样和MPE中IL-17、IL-23、TGF-β1表达水平。操作步骤严格参照试剂盒说明书进行。

1.8 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析检验，两组间比较采用两独立样本t检验，计数资料用百分数表示，行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胸腔解剖及CT检查结果 见图1，图2。建模后第14日，各组小鼠行胸部CT检查，结果正常对照组小鼠肺野清晰，胸膜光整，而模型组可见大量胸腔积液生成，顺铂组、逐水饮组和逐水饮+顺铂组胸腔积液减少（见图1）。处死小鼠，剖开胸骨，暴露胸壁，正常对照组小鼠可观察到双肺色白，胸壁光滑，而模型组小鼠明显可见血性胸腔积液（见图2，白色箭头所示为血性胸腔积液）。

图1 各组小鼠胸部CT扫描图

图2 小鼠胸腔解剖图

2.2 各组小鼠MPE体积、胸壁转移瘤数、转移瘤质量及生存期比较 见表1。与模型组比较，逐水饮组、顺铂组和逐水饮+顺铂组小鼠MPE体积减小（P＜0.05），胸壁转移瘤数目减少（P＜0.05），转移瘤质量减轻（P＜0.05），生存期延长（P＜0.05）；逐水饮组和顺铂组小鼠MPE体积、胸壁转移瘤数目、转移瘤质量和生存期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与逐水饮组和顺铂组比较，逐水饮+顺铂组小鼠MPE体积、胸壁转移瘤数目、转移瘤质量和生存期变化更加明显（P＜0.05）。

表1 各组小鼠MPE体积、胸壁转移瘤数、转移瘤质量及生存期比较（±s）

表1 各组小鼠MPE体积、胸壁转移瘤数、转移瘤质量及生存期比较（±s）

与模型组比较，∗P＜0.05；与逐水饮组比较，△P＜0.05；与顺铂组比较，▲P＜0.05

组别模型组逐水饮组顺铂组逐水饮+顺铂组n 8 8 8 8 MPE体积（μL）683.95±57.52314.67±41.17*346.82±48.39*265.83±30.42*△▲胸壁转移瘤数（个）8.91±0.766.24±0.58*5.66±0.61*4.17±0.38*△▲转移瘤质量（mg）778.65±82.34513.71±62.79*446.91±71.24*311.24±47.28*△▲生存期（d）18.27±2.1921.22±1.94*21.06±2.03*23.59±1.37*△▲

2.3 各组MPE及外周血中Th17、Treg细胞百分比比较 见图3～图4，表2。与模型组比较，逐水饮组、顺铂组和逐水饮+顺铂组小鼠MPE和外周血中Th17细胞百分比升高（P＜0.05），MPE中Treg细胞百分比降低（P＜0.05）；逐水饮组和逐水饮+顺铂组小鼠MPE和外周血中Th17细胞百分比高于顺铂组（P＜0.05），Treg细胞百分比低于顺铂组（P＜0.05）；逐水饮+顺铂组小鼠MPE和外周血中Th17、Treg细胞百分比与逐水饮组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；各组小鼠MPE中Th17、Treg细胞百分比均高于其外周血中Th17、Treg细胞百分比（P＜0.05）。

图3 各组小鼠MPE中Th17、Treg细胞比例流式图

图4 各组小鼠外周血中Th17、Treg细胞比例流式图

表2 各组小鼠MPE及外周血中Th17、Treg细胞百分比比较（±s）

表2 各组小鼠MPE及外周血中Th17、Treg细胞百分比比较（±s）

与正常对照组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与顺铂组比较，#P＜0.05；与本组外周血比较，▲P＜0.05。下同。

组别正常对照组模型组逐水饮组顺铂组逐水饮+顺铂组n 8 8 8 8 8 Th17 MPE—0.72±0.11▲1.24±0.26△#▲0.88±0.15△▲1.37±0.19△#▲外周血0.97±0.150.51±0.09*0.75±0.17△#0.65±0.11△0.86±0.20△#Treg MPE—14.01±3.147.12±2.05△#▲10.52±2.33△▲6.83±1.74△#▲外周血1.51±0.392.87±0.93*1.74±0.52△#2.58±0.71△1.66±0.47△#

2.4 各组MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子表达水平比较 见表3。与正常对照组比较，模型组外周血中IL-17、IL-23水平降低（P＜0.05），TGF-β1水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，逐水饮组、顺铂组和逐水饮+顺铂组MPE和外周血中IL-17、IL-23水平升高（P＜0.05），TGF-β1水平降低（P＜0.05）；逐水饮组和逐水饮+顺铂组MPE和外周血中IL-17、IL-23水平高于顺铂组（P＜0.05），TGF-β1水平低于顺铂组（P＜0.05）；逐水饮组和逐水饮+顺铂组MPE和外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组小鼠MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子表达水平比较（pg/mL，±s）

表3 各组小鼠MPE及外周血中IL-17、IL-23、TGF-β1因子表达水平比较（pg/mL，±s）

组别正常对照组模型组逐水饮组顺铂组逐水饮+顺铂组n 8 8 8 8 8 IL-17 MPE—18.53±2.5727.64±1.85△#23.37±2.14△28.69±1.91△#外周血23.91±2.1214.17±1.76*20.52±2.01△#17.43±1.58△21.72±1.83△#IL-23 MPE—11.54±2.6219.38±2.15△#16.57±1.73△20.11±2.05△#外周血16.53±1.948.39±1.44*13.52±1.86△#10.75±1.51△14.18±2.11△#TGF-β1 MPE—36.38±2.1912.75±1.96△#15.23±2.05△11.18±1.54△#外周血8.44±1.1530.42±2.51*10.33±1.62△#12.54±1.71△9.88±1.47△#

3 讨 论

MPE为胸膜直接受累或肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、消化系统恶性肿瘤等转移至胸膜而引起胸膜腔液生成过快和（或）吸收减慢，导致液体积聚于胸膜腔［8］。约有5%～10%的MPE找不到原发肿瘤灶，一旦出现则预后不良，中位生存期仅为4个月［9-10］。中医药治疗MPE，可通过趋化免疫炎性细胞、调节整体免疫功能、抑制化学性胸膜炎形成等多种途径发挥抗肿瘤、抑制MPE形成，疗效确切、作用温和、毒副作用小，为肿瘤晚期及年老体弱患者的MPE治疗提供了更多选择［11］。

中医学认为，MPE归属“悬饮”“支饮”范畴，津液失布，邪流胸胁，阻滞三焦，水饮积结，发为胸腔积液，以行气利水、化瘀散结兼顾护正气为主要疗法［12］。本研究结果显示，与模型组比较，逐水饮组、顺铂组和逐水饮+顺铂组小鼠MPE体积、胸壁转移瘤数目减少，转移瘤质量减轻，生存期延长，说明逐水饮和顺铂对MPE和肿瘤生长均具有一定抑制作用。逐水饮+顺铂组小鼠MPE体积、胸壁转移瘤数目、转移瘤质量和生存期与逐水饮组和顺铂组比较有明显差异，提示逐水饮和顺铂联用对肿瘤和MPE的抑制作用更加明显。化疗药物能直接杀死或抑制肿瘤细胞增殖，但副作用明显，部分患者耐受性较差，结合中药逐水饮扶正祛邪，可减轻其毒副作用，改善患者耐受性，促进胸腔积液消退［13-14］。研究也证实中药口服汤剂（如宣肺逐饮方、温肺化饮方、葶苈甘遂逐水饮等）联合顺铂胸腔灌注治疗肺癌MPE的疗效较单用顺铂更佳［15］。

MPE的产生、发展与其微环境密切相关，其中免疫细胞在MPE微环境中起重要作用，机体细胞免疫主要由CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒T细胞介导，已有研究表明MPE中Th17/Treg细胞失衡提示预后不良［16-18］。本研究观察各组小鼠MPE和外周血Th17细胞、Treg细胞水平，结果各组小鼠MPE中Th17、Treg细胞百分比均高于其外周血。与模型组比较，逐水饮组、顺铂组和逐水饮+顺铂组小鼠MPE和外周血中Th17细胞百分比升高，逐水饮组和逐水饮+顺铂组小鼠MPE和外周血中Treg细胞百分比降低。说明模型组小鼠MPE的微环境中Treg细胞较Th17细胞占优势，可能因为小鼠直接胸腔接种，肿瘤细胞生长过快，免疫功能受到明显抑制，Treg细胞升高较Th17细胞更加明显，使Th17/Treg平衡偏向Treg细胞，而逐水饮可逆转Th17/Treg细胞失衡状态。TGF-β是决定初始CD4+T细胞向Th17细胞或Treg细胞分化的关键细胞因子［19］。本研究观结果显示，与模型组比较，逐水饮组、顺铂组和逐水饮+顺铂组MPE和外周血中Th17细胞相关细胞因子IL-17、IL-23水平升高，Treg相关细胞因子TGF-β1水平降低。说明逐水饮可抑制TGF-β1分泌，促进Th17细胞分化及IL-17、IL-23表达，从而促进肿瘤免疫反应，消除胸腔积液。

综上所述，中药逐水饮具有一定抑制小鼠胸腔积液的作用，且与化疗药物联合应用时作用更加明显。小鼠MPE微环境中Th17细胞失衡，逐水饮能够促进Th17细胞分化及相关细胞因子表达，纠正微环境中Th17细胞失衡，减轻MPE微环境免疫抑制状态，增强对肿瘤的免疫作用，发挥治疗MPE作用。