TRFIA法检测HBV表面抗原最佳临界值及灰区探讨

叶 莎,魏 娜

(1.巴音郭楞蒙古自治州人民医院检验科，新疆库尔勒 841000;2.北京市中西医结合医院检验科,北京 100089)

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种全球性的流行病，而其是我国感染人数最多、流行最广泛、危害最严重的病毒性肝炎之一。HBV感染最先出现的标志物是HBV表面抗原[1]，因此，HBV表面抗原的检出有利于乙型肝炎的早期诊断、治疗及预防传播。HBV表面抗原常用的检测方法是 ELISA 方法,但由于ELISA法检测影响因素较多，近几年实验室逐渐开展时间分辨荧光免疫试验(TRFIA)检测HBV表面抗原,其原理是采用双抗体夹心时间分辨荧光分析法，以单克隆抗体包被反应板，镧系元素Eu3+标记抗体，并与时间分辨测定技术相结合建立起来的一种新型非放射性微量分析技术[2]。该方法具体灵敏度高、发光稳定、寿命延长、自然荧光干扰少等优点[3]。HBV表面抗原定量试剂已由最初的一代试剂发展为二代试剂，其检测的敏感性显著的提高，同时假阳性率是否会增高？各厂家试剂产品说明书提供的临界值不尽相同，同时试剂厂家所使用的定值参考人群也不同[4]，因此，需要对临界值进行设定。此外，在临床工作中发现，根据厂家给定的临界值(0.05 IU/mL)判断检验结果，易出现假阳性，导致部分患者的误诊，会引起患者及家属的恐慌，造成巨大的负面影响。由于TRFIA法灵敏度高，从而有一部标本呈现弱阳性，即灰区。研究报告[5-6 ]指出灰区的标本容易漏诊或误诊。目前，关于TRFIA检测乙肝表面抗原临界值及灰区鲜见报道，因此，本研究根据本实验条件，探讨TRFIA法检测乙肝表面抗原的最佳临界值及灰区，制定适合本实验室最佳临界值和灰区，为临床乙型肝炎病毒感染的诊断提供可靠依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2018年6月来某三甲医院住院患者或体检者血清或血浆经TRFIA检测乙肝表面抗原阳性的标本150例和接近临界值(阴性)标本30例，其中定量值在0.03～<0.05 IU/mL有30例，0.05～<0.10 IU/mL有50例，0.1～<0.2 IU/mL有40例，0.2～<0.5 IU/mL有30例，0.5～1.0 IU/mL有30例。所有标本均无任何凝集不完全、溶血、黄疸及脂血现象。

1.2仪器与试剂 苏州新波EasyCuta全自动时间分辨荧光免疫分析仪及配套HBV表面抗原诊断试剂盒，雅培Architect i2000化学发光微粒子免疫分析系统及配套HBV表面抗原诊断试剂,所有试剂均在有效期内。每日使用两个水平的质控品监测质控情况，两质控品的浓度分别是0.5 IU/mL和1 IU/mL(北京康彻思坦公司生产),批号均是201803001。

1.3方法

1.3.1精密度的评价 批内精密度用TRFIA检测法对两浓度水平的质控品在同一批次内平行检测20次，记录定量值，然后计算均值、s和CV(标准为CV不大于10%[7])。批间精密度在批内精密度符合要求的基础上，用TRFIA检测法对两浓度水平的质控品连续检测20天,每天平行检测复孔，记录其定量值，然后计算均值、标准差(s)和变异系数(CV,标准为CV不大于10%[7])。

1.3.2TRFIA检测HBV表面抗原 专业人员严格遵守Easycuta全自动时间分辨荧光分析仪操作规程进行操作。有校准品从A至F,依次为校准品A:空白；校准品B：0.05 IU/mL；校准品C:0.20 IU/mL；校准品D：2.00 IU/mL校准品E：20.00 IU/mL；校准品F:150.00 IU/mL。试剂说明书临界值建议浓度为0.05 IU/mL。

1.3.3HBV表面抗原确证试验 采用化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)进行确认，专业人员严格按照Architect i2000化学发光微粒子免疫分析仪操作规程进行操作。所有标本均检测两次，两次检测结果均≥0.05 IU/mL时为阳性；两次结果不一致时，重复检测一次，三次均值≥0.05 IU/mL为阳性，反之为阴性。

1.4统计学处理

1.4.1利用统计学软件SPSS19.0录入数据，TRFIA法检测结果与确认试验结果比较采用四格表Fisher确切概率法。绘制ROC曲线，判定最佳临界值。利用公式临界值±2CV[8]，计算其灰区，这里的CV为批间精密度变异系数。

1.4.2TRFIA法检测结果与确认试验一致性比较采用Kappa值来表示，Kappa的计算参考文献[9]。

2 结果

2.1批内、批间精密度评价 两浓度水平的质控品，按照1.3.1方法检测，批内精密度分别为6.82%和5.26%，批间精密度分别为8.29%和7.31%，见表1。

表1 批内、批间精密度评价

2.2TRFIA法检测HBV抗原结果与确证试验比较 TRFIA检测HBV抗原浓度在0.03～0.05 IU/mL的30阴性标本，经确证1例阳性(占3.3%)，29例阴性(占96.7%)；浓度在0.05～1.00 IU/mL的150例阳性标本，经确证132例阳性(占88.0%)，18例阴性(占12.0%)，见表2。

表2 TRFIA法检测HBV抗原结果与确证试验比较

2.3TRFIA法检测结果与确证试验一致性的比较 根据1.4.2中的公式计算，TRFIA法检测结果与确证试验结果一致性的Kappa值为0.690，TRFIA法检测结果与确证试验比较，差异有统计学意义(χ2=4.774，P=0.039)，见表3。

表3 两种方法结果比较(n)

2.4最佳临界值判定 利用SPSS19.0软件绘制ROC曲线见图1，该曲线下面积为0.924，其与ROC曲线下面积0.5比较,差异有统计学意义(P<0.001)。计算约登指数,并以约登指数最大时，即0.794，其对应的切点为临界值，此时临界值为0.074 IU/mL。

图1 ROC曲线

2.5新临界值下TRFIA法检测结果与确证试验一致性的比较 根据1.4.2中的方法计算，此时的一致性Kappa值为0.814，见表4。

2.6灰区的判定 根据1.4.1中的计算公式得出，灰区(CV值取最大为10%),灰区为范围-0.126～0.274 IU/mL。试剂说明书给定的灰区范围为0.04～0.06，给定的临界值为0.05 IU/mL，两灰区上限或下限时灵敏度、特异度、假阳性率和假阴性率见表5。灰区下限的设定是为了减少漏诊率，减少假阴性的发生，而上限设定是为了减少误诊率，减少假阳性的发生。统计学认为小于或等于5%为统计学可接受范围，因此，灰区的下限设定应满足假阴性率≤5%，而上限是设定应满足假阳性率≤5%，从而确定灰区为0.05～0.274 IU/mL，见表5。

表4 新临界值下两种方法结果比较(n)

表5 灰区上限/下限时的敏感性、特异性、假阳性率和假阴性率(%)

注：-表示下限时无法计算假阳性数或上限时无法计算假阴性数

3 讨论

ELISA法是检测HBV表面抗原的常规方法,但由于整个检测过程受外部环境、温度、检测人员等多种因素的影响，因此，近几年TRFIA方法逐渐走进实验室，替代ELISA方法。TRFIA是一种新型非放射性微量分析技术，目前已在临床检测中广泛使用。本研究首先评估全自动时间分辨荧光仪的检测系统的精密度能否满足定量实验精密度的要求。采用浓度为0.5 IU/mL和1 IU/mL的质控品进行检测，监测两浓度水平的批内精密度CV分别为6.82%和5.26%，批间精密度CV分别为8.29和7.31%，均能满足CV不大于10%的标准。

CMIA定量检测HBV表面抗原是利用生物素标记抗-HBs技术、亲和素标记磁性微珠包被技术及电化学发光技术相结合而建立的微量分析技术。该方法具有高度的灵敏度与特异性，解决低浓度的问题，检测准确率高[10-11]。本研究利用CMIA法对TRFIA方法检测定量浓度在0.03～1.00 IU/mL的180例标本进行确认，经确证133例阳性，47例阴性，TRFIA法检测结果与确证试验结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)。利用Kappa系数评估TRFIA与确证试验结果一致性，当Kappa值大于等于0.75时表明两种方法的一致性较好；当Kappa值大于等于0.4，而小于0.75时，表明两种方法的一致性一般；当Kappa值小于0.4时表明两种方法一致性很差[12]。本实验室TRFIA方法与确证试验检测结果一致性的Kappa值为0.690，表明两种方法定性结果的一致性一般，因此，需要对临界值进行调整。

ROC曲线法是较为实用、较为便捷的统计学方法,其能较准确的确定方法学的临界点[13]。而常用约登指数来评价筛查试验的真实性,其指数越大，说明该筛查实验的真实性越好，准确性越高[7]。本实验利用ROC曲线，取约登指数最大时的拐点，确定最佳临界值为0.074 IU/mL，此时，ROC曲线下面积为0.924。ROC曲线下面积在0.5～1.0，而当ROC曲线下面积在 0.9～1.0时，才具有较高的诊断价值[14]。本实验ROC曲线下面积为0.924，因此说明定量试验有较高的诊断价值。在新的临界值下，TRFIA方法与确证试验一致性的Kappa值为0.814，大于0.75，表明此时，两种方法的一致性较好，也提示新的临界值有一定的临床应用价值。

TRFIA方法相对于传统的 ELISA 方法检测的灵敏度有显著的提高，但是同时也出现一定的弱阳性标本，即灰区，灰区范围的设定非常重要，范围设置过窄容易漏检，过宽容易造成资源浪费。本研究根据临界值±2CV法确定的灰区范围为-0.126～0.274 IU/mL，灰区的下限-0.126 IU/mL，显然不合理(所有阴性均可疑)，大于灰区上限的标本中有2.13%的假阳性率，小于5%统计学上可接受的误差范围。试剂说明书给定的灰区范围为0.04～0.06 IU/mL,在小于灰区下限的标本中假阴性率为0%,小于5%统计学上可接受的误差范围。而大于灰区上限的标本中假阳性率为14.89%，大于5%统计学上可接受的误差范围，因此设置不合理。试剂说明书给定的临界值为0.05 IU/mL，而以0.05 IU/mL作为灰区的下限时，小于灰区下限的标本中有1.50%假阴性率，小于5%统计学上可接受的误差范围。相比较于灰区下限0.04 IU/mL，0.05 IU/mL作为灰区的下限既能满足统计学可接受的误差范围，又不至于灰区范围过宽，导致资源的浪费。因此，综合考虑，本研究得出本实验室的灰区范围为0.05～0.274 IU/mL，对本实验室有较佳的参考意义。

4 结论

通过本研究发现本实验室TRFIA法检测HBV表面抗原的最佳临界值0.074 IU/mL，灰区为0.05～0.274 IU/mL，与试剂说明给定临界值的0.05 IU/mL，灰区0.04～0.06 IU/mL有一定的差别。因此，各实验室应根据本实验室的实际情况，对TRFIA法检测HBV表面抗原的临界值及灰区进行重新设定。对于定量值在灰区的标本，工作人员应与患者或其医师沟通，了解情况后，综合判断，客观报告“结果可疑，定期复查”。