高效液相色谱法测定石金解毒口服液中绿原酸的含量

郭社民姬金霞

（1 河南省濮阳市食品药品检验检测中心，河南 濮阳 457000；2 河南省濮阳市人民医院，河南 濮阳 457000）

石金解毒口服液是结合多年中医临床应用经验研制的医院制剂，由金银花、玄参、地黄、芦根、连翘、天门冬、栀子、黄芩、龙胆草、甘草、石膏等11味药材组成。经临床实践证实，石金解毒口服液具有清热解毒之功效，用于热毒雍盛所致发热、烦躁口渴、咽喉肿痛、流感、上呼吸道感染见上述症状者。石金解毒口服液原质量标准中没有含量控制的方法，为提高质量标准有效控制其质量，保证临床用药疗效，参照有关文献［1-4］，对君药金银花的有效成分绿原酸进行了定量研究，建立了高效液相色谱法测定石金解毒口服液中绿原酸含量的方法。

1 仪器与试药

安捷伦1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦）；UVIKONxl型紫外分光光度计（法国塞克曼公司）；XS205DU型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）。绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为：110753-201314）；石金解毒口服液（批号分别为20180726，20181003，20181225）及阴性样品均由濮阳市中医医院制剂室提供；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4% 磷酸溶液 （13∶87）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长327 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。在该色谱条件下，理论塔板数按绿原酸计算应不低于3000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液 精密称取绿原酸对照品适量，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含绿原酸1.619 5 mg的溶液，作为对照品储备液。精密量取绿原酸对照品储备液2 mL，置50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取石金解毒口服液3 mL，置50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 取处方中不含金银花的其它药材同比例制备的阴性样品，按“2.2.2”项下的方法，制成阴性对照溶液。

2.3 阴性干扰试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果表明阴性对照溶液对绿原酸的测定无干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图

2.4 线性关系的考察 分别精密量取对照品储备液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL，置 25 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件分别精密吸取20 μL进样，记录色谱图，以绿原酸峰面积Y为纵坐标、对照品溶液浓度（mg·mL-1）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=3.941×104+19.47，r=0.999 9。结果表明，绿原酸在0.025 9～0.103 6 mg·mL-1范围内，浓度与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验 取“2.2.1”项下的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样5次，测定绿原酸峰面积，计算RSD为0.37%（n=5），表明精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温下放置，于0，2，4，6，8，10 h，精密吸取 20 μL，注入效液相色谱仪，测定绿原酸峰面积，计算RSD为6.53%，表明供试品溶液至少在10 h内稳定。

2.7 重复性实验 取同一批号供试品（批号20180726），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，按外标法计算含量，绿原酸的平均含量为4.273 6 mg·mL-1，RSD为0.76%，表明本方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验精密量取已知含量（4.273 9 mg·mL-1）的同一批样品（批号20180726） 1.5 mL，共9份，每3份为一组，分别精密加入绿原酸对照品储备液2.0，3.0，4.0 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别测定，计算回收率，结果见表1。

表1 绿原酸回收率试验结果 （n=9）

2.9 样品含量测定 取样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录绿原酸色谱峰面积，按外标法计算含量，结果见表2。

表2 绿原酸含量测定结果 （mg·mL-1，n=3）

3 讨论

（1）近年来，随着中医理论和制药工艺事业的发展，中药医院制剂也在迅速发展和提高，为方便医院内部临床用药，结合临床经验研制出了许多使用方便、疗效明显的中药医院制剂。中药制剂处方的特点是由多味中药材组成，既要根据病人临床症状表现对症下药，还要遵循中药配伍原则，各味药之间配伍得当［5-6］。由于制剂的处方复杂，生产工艺各异，这就给质量标准的制定带来了一定的困难，一般以处方中的主药药材和有效成分作为研究对象。石金解毒口服液的处方中，金银花为主药且用量大，金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花。夏初花开放前采收，干燥而得［7］。金银花的主要成分为绿原酸、木犀草黄素及木犀草黄素-7-葡萄糖苷等［8］，其中绿原酸具有广谱抗菌、增强免疫力及解热抗炎等药理活性。主要功效［9］为抗菌消炎，对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾球菌、肺炎球菌、伤寒杆菌、有明显的抑菌效果，同时还有抗病毒、抗肿瘤、降血压和降血脂等作用。通过方法学验证，结果表明采用高效液相色谱法能够准确测定石金解毒口服液中绿原酸的含量，故通过建立绿原酸的含量测定方法，来更好的控制该制剂的质量。

（2）检测波长的选择，在200～400 nm波长范围内对绿原酸对照品溶液进行紫外光谱扫描，结果绿原酸在327 nm处有最大吸收，故选用327 nm作为测定波长。

（3）在供试品溶液制备过程中，对稀释溶剂进行了考察，曾分别用甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇、流动相等为溶剂试验，结果以50%甲醇为溶剂，供试品溶液澄清，不产生干扰，在配置绿原酸对照品溶液时，用50%甲醇为溶剂能够使绿原酸对照品完全溶解，故选用50%甲醇为溶剂。

（4）流动相组分和比例的选择。曾试用乙腈∶甲醇∶冰醋酸 （96∶6∶11∶2）、乙腈∶1% 冰醋酸溶液、乙腈∶2% 磷酸溶液、乙腈∶1%磷酸溶液、乙腈∶0.4%磷酸溶液，结果流动相组分以乙腈∶0.4%磷酸溶液较好，同时发现流动相的比例对主峰的峰形影响较大，经过试验比较，以乙腈∶0.4% 磷酸溶液 （13∶87） 为流动相时，绿原酸与其他相邻峰分离度符合要求，且峰形较好，故选乙腈∶0.4%磷酸溶液 （13∶87） 为流动相。