新型四环素药物Eravacycline体外诱导金黄色葡萄球菌耐药16S rRNA基因突变位点分析

李桂秋　魏影　余治健　陈俊文　钟婉莹　陈重

【摘要】 目的：研究Eravacycline體外诱导金黄色葡萄球菌耐药菌株的核糖体30S亚基16S rRNA基因和核糖体蛋白变异特点，阐明金黄色葡萄球菌Eravacycline耐药机制。方法：选择3株金黄色葡萄球菌株，采用Eravacycline不同压力浓度下逐渐诱导Eravacycline耐药金黄色葡萄球菌耐药菌株，挑取诱导菌株单克隆，采用琼脂平板稀释法测定母株及诱导系列的Tigecycline和Eravacycline的MIC值;通过PCR扩增其5个拷贝的16S rRNA基因（RR1-RR5）和30S核糖体蛋白基因，将诱导的Eravacycline耐药株扩增产物测序后与母株序列比较，获得该基因片段突变位点。结果：经过体外Eravacycline不同浓度梯度多步诱导共挑取6株Eravacycline耐药菌株，这些菌株的Tigecycline和Eravacycline的MIC值范围分别为8～16 μg/mL和32～64 μg/mL。16S rRNA基因PCR测序分析提示该基因的主要突变位点分别为RR1（T170G）、RR2（A1124G，G77A）、RR3（C810T）、RR4（G185A，G1036A），30S亚基核糖体蛋白S3蛋白没有突变，30S亚基核糖体蛋白S10基因多个位点突变。结论：金黄色葡萄球菌Eravacycline诱导耐药后可导致Tigecycline和Eravacycline的交叉耐药及16S rRNA基因和30S亚基核糖体蛋白S10位点突变。

【关键词】 MRSA; MSSA; Evacycline诱导耐药; 16S rRNA基因

Genetic Mutation of 16S rRNA Genes in Eravacycline-resistant Staphylococcus Aureus in Vitro Induced Under Eravacycline Pressure/LI Guiqiu，WEI Ying，YU Zhijian，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（18）：-146

【Abstract】 Objective：To study the mutation characteristics of ribosomal 30S subunit 16S rRNA gene and ribosomal protein in Staphylococcus aureus resistant strains induced by Eravacycline in vitro，to elucidate the resistance mechanism of Staphylococcus aureus Eravacycline.Method：3 strains of Staphylococcus aureus were selected to induce drug-resistant Staphylococcus aureus strains with Eravacycline at different pressure concentrations.Monoclones of the induced strains were selected.The MIC values of Tigecycline and Eravacycline in the mother strain and induction series were determined by agar plate dilution method.5 copies of the 16S rRNA gene（RR1-RR5）and 30S ribosomal protein gene were amplified by PCR.The amplified products of the induced Eravacycline resistant strain were sequenced and compared with the sequence of the parent strain to obtain the mutation site of the gene fragment.Result：6 strains of Eravacycline-resistant strains were selected by multi-step induction with different concentration gradients in vitro，the MIC values of Tigecycline and Eravacycline of these strains ranged from 8 to 16 μg/mL and 32 to 64 μg/mL respectively.PCR sequencing analysis of 16S rRNA gene indicated that the main mutation sites of the gene were RR1（T170G），RR2（A1124G，G77A），RR3（C810T），RR4（G185A，G1036A），30S subunit ribosomal protein S3 protein had no mutation，and 30S subunit ribosomal protein S10 gene had multiple mutations.Conclusion：After Staphylococcus aureus Eravacycline induced drug resistance can lead to cross-resistance of Tigecycline and Eravacycline，mutation of 16S rRNA gene and S10 site of 30S subunit ribosomal protein.

【Key words】 MRSA; MSSA; Evacycline resistance; 16S rRNA gene

First-authors address：Shenzhen Nanshan Peoples Hospital，Shenzhen 518052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.18.038

金黄色葡萄球菌是G+细菌的代表菌，主要分布在人体皮肤表面、鼻咽部和肠道，该细菌通过内外毒素及免疫病理可引起呼吸系统、血流、伤口等组织化脓性感染[1-2]。耐甲西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）是由mecA基因编码的一种pbp2A蛋白，此蛋白与甲氧西林亲和力低，该类细菌临床治疗选择极为有限，开发金黄色葡萄球菌治疗药物尤其是MRSA治疗的有效药物是临床的紧迫问题[1]。

四环素类抗生素作用于细菌核糖体30S亚基，体外晶体结构分析四环素的作用机制是与30S小亞基16S rRNA和核糖体蛋白相互作用，阻止氨基酰-tRNA转运从而干扰蛋白质合成[2-3]。Tetrapnase制药公司研发的新型四环素类抗生素Eravacycline结构类似于替加环素，对G+细菌具有良好抑制活性和最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值，目前尚无金黄色葡萄球菌临床耐药株的报道[4]。因此本实验利用Eravacycline体外诱导金黄色葡萄球菌耐药株，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增核糖体基因并测序分析，观察体外诱导Eravacycline诱导的耐药株是否和tigecycline存在交叉耐药以及是否在30S亚基的16S rRNA基因和核糖体蛋白S10基因上出现变异位点，揭示金黄色葡萄球菌Eravacycline耐药的潜在规律。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株的复苏鉴定及Eravaycycline耐药菌诱导 将

2株MSSA（编号MS7和MS8）和1株MRSA菌株（编号MR2）采用血平板复苏，由BD phonixtm 100公司全自动药敏鉴定系统和质谱仪鉴定菌种，质控菌株为ATCC29213[5]。

1.2 体外诱导Eravacycline耐药金黄色葡萄球菌 将

3株金黄色葡萄球菌分别接种到MH平板培养基中复苏。挑取单克隆菌落，根据母株的MIC值，诱导的起始浓度为1/2MIC的Eravacycline（MCE公司），诱导浓度为1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC，各浓度梯度诱导4～8代，诱导下一梯度时需接平板质谱鉴定，当细菌生长抑制时需降低化合物浓度重复传代培养，每代37 ℃培养12～14 h，诱导终止时挑取单克隆用无抗血平板筛查传3代，进行MIC值测定和DNA提取及PCR[6]。

1.3 MIC值的检测 按美国CLSI2017年规定的标准，采用琼脂平板稀释法检测3株母株及相对应的6株诱导株的Tigecycline和Eravacycline的MIC值。

1.4 16S rRNA基因片扩增和测序 16S rRNA的5个拷贝基因片段：RR1（2 086 bp）、RR2（2 075 bp）、RR3（1 936 bp）、RR4（1 756 bp）和RR5（2 345 bp）。

引物委托北京六合华大基因公司合成（引物Primer 5.0软件设计，引物序列见表1）。采用TAKARA试剂盒提取菌株基因组DNA，-20 ℃保存备用。采用PCR方法检测基因RR1、RR2、RR3、RR4和RR5，扩增条件如下：反应体系50 μL，Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）25 μL，Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，Template DNA 2 μL，加dd H2O补齐至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95℃变性30 s，RR1、2、3、4、5，S3，S10的退火温度分别为50 ℃，49 ℃，51 ℃，RR1、2、3、4、5，S3，S10的延伸时间分别为2 min，1 min，1 min，共35个循环，72 ℃后延伸10 min，PCR产物于4 ℃保存。PCR反应产物均用1%的琼脂糖凝胶电泳，对电泳阳性产物送华大基因公司测序，测序结果采用DNAMAN比对诱导株和拷贝16S rRNA序列与野生株间差异寻找变异位点。同样方法扩增30S核糖体亚基蛋白S3和S10，通过变异株和母株基因比对寻找耐药相关变异位点。

2 结果

2.1 耐药株鉴定及MIC值测定 结果显示，3株金葡诱导前均对Eravacycline敏感;3株母株菌经过多步法体外诱导后，其Eravacycline MIC值显著增高，得到不同MIC值梯度的菌株，Eravacycline MIC值达8～16 μg/mL;Eravacycline耐药株的Tigecycline MIC值波动在32～64 μg/mL，见表2。

2.2 16S rRNA基因和核糖体蛋白测序分析 变异位点3株母株和诱导耐药株的16S rRNA基因比对提示主要突变位点分别为RR1（T170G）、RR2（A1124G，G77A）、RR3（C810T）、RR4（G185A，G1036A），其中30S核糖体蛋白S3没有突变，30S核糖体蛋白S10蛋白基因41、47、87位点突变，见表3。

3 讨论

既往有研究报道了我国金黄色葡萄球菌临床分离株Eravacycline的敏感性及异质性耐药发生比例，提示Eravacycline对于临床株具有较好的敏感性[7-8]，目前尚无金黄色葡萄球菌中Eravacycline耐药株的报道，但对于异质性耐药的发生值得临床密切关注并深入研究。本研究选择Eravacycline对3株金黄色葡萄球菌进行诱导耐药实验，结果提示获得Eravacycline高浓度耐药株。Eravacycline为FDA2018审批通过的新型抗生素，目前折点对于金黄色葡萄球菌的推荐为0.5 μg/mL，本研究获得的Eravacycline诱导金黄色葡萄球菌株的MIC值远远高于这一折点，因此通过体外诱导成功获得Eravacycline耐药金黄色葡萄球菌菌株。

细菌对四环素耐药机制主要为通过外排泵主动外排;通过核糖体保护蛋白解离;通过对四环素的酶解作用。既往多项研究提示核糖体30S亚基16S rRNA和核糖体蛋白S3及S10变异与四环素类耐药密切相关[9-11]。细菌含有多个16S rRNA拷贝，不同细菌研究提示四环素导致的16S rRNA基因变异位点在不同拷贝的16S rRNA变异位点并不一致，这可能与四环素作用的空间结构复杂密切相关。Eravacycline因为特殊的基团免疫这些抵抗机制[12-13]。

本研究经Eravacycline诱导耐药后的3组诱导菌株与母株经16S rRNA基因测序后发现，金黄色葡萄球菌16S rRNA的5个拷贝中不同细菌的RR1、RR2、RR3、RR4间有共同突变位点，RR5无规律，30S亚基核糖体蛋白S10基因突变无规律。文献[14-15]结果提示替加环素诱导金黄色葡萄球菌16S rRNA变异与本研究结果一致，因此在新型替加环素等药物诱导下细菌16S rRNA基因变异规律及其意义仍有到进一步研究。本研究提示通过体外诱导金黄色葡萄球菌可获得Eravacycline耐药菌株，这类菌株同时对Tigecycline產生耐药性;随着Eravacycline药物压力增加和时间延长，其MIC值会增加;Eravacycline诱导可以导致16S rRNA基因突变和核糖体蛋白S3和S10突变，这些位点突变与耐药的临床意义和规律仍有待进一步研究揭示。

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