屎肠球菌临床分离株Eravacycline体外活性及四环素耐药基因特征分析

魏影　郭妍　柏柳　陈艳丽　黄嵘赫　王德辉　余治健　陈俊文　钟婉莹　陈重　李桂秋

【摘要】 目的：分析新型四环素药物Eravacycline对我国屎肠球菌药物敏感性及分子分型特点。方法：收集深圳市南山区人民医院和哈尔滨医科大学附属第四医院屎肠球菌共235株。经BD phonixtm 100公司全自动药敏鉴定系统检测其常规药物药敏，琼脂稀释法测定Eravacycline药物敏感性，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测四环素抗性基因（tetM、tetL、tetU、tetK、tetS和tetO）。分析Eravacycline药敏与四环素耐药基因之间关系。结果：Eravacycline对屎肠球菌的MIC值≤0.5 μg/mL;

四环素耐药基因检测结果提示屎肠球菌tetM+tetL+tetU为18.30%（43/235），tetM+tetL为27.23%（64/235），所有含有四环素耐药基因的屎肠球菌的MIC≤0.5 μg/mL。结论：Eravacycline对我国屎肠球菌临床分离株具有较好的敏感性，四环素耐药基因对Eravacycline无影响。

【关键词】 屎肠球菌; 四环素耐药基因; Eravacycline; 抗感染药物敏感性

In Vitro Activity of Eravacycline and Characterisitics of Tetracycline Specific Resistance Genes in Enterococcus Faecium Clinical Isolates/WEI Ying，GUO Yan，BAI Liu，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（18）：-110

【Abstract】 Objective：To investigate the antimcirobial susceptibility of Eravacycline and the distribution of Tetracycline specific resistance genes in Enterococcus faecium clinical isolates.Method：A total of 235 strains of Enterococcus faecium were collected from Shenzhen Nanshan Peoples Hospital and the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University from 2011 to 2016.The antimicrobial susceptibility of the commonly used antbiotics on Enterococcus faecium clinical isolates were determined by the automatic drug sensitivity identification system（BD phonixtm 100），the minimal inhibitory concentration（MIC）of Eravaycline was measured by agar dilution method，polymerase chain reaction（PCR）was carried out to detect the presence of tetracycline specific resistance genes，including tetM，tetL，tetU，tetK，tetS and tetO.Result：Eravacycline exhibitted the good in vitro activity against Enterococcus faecium clinical isolates with the MIC as low as ≤0.5 μg/mL.The presence of tetM+tetL+tetU and tetM+tetL were the most common combination of the Tetracycline resistance genes，indicating the frequency were 18.3%（43/235）and 27.23%（64/235）respectively.Conclusion：The clinical isolates of Enterococcus faecium in China are susceptible to Tetracycline，but the resistance gene on Tetracycline has no effect on Eravacycline.

【Key words】 Enterococcus faecium; Tetracycline specific resistance genes; Eravacycline; Antimicrobial susceptibility

First-authors address：Heilongjiang Medical Service Management Evaluation Center，Harbin 150036，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.18.028

根據2015年中国细菌耐药监测网显示屎肠球菌感染在革兰阳性菌感染排在第五位。该类细菌对低浓度氨基糖苷类、头孢菌素、克林霉素等呈现天然耐药表型，近年来屎肠球菌对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺等主要治疗药物耐药报道逐渐增多，全世界多个地区已经出现了耐万古霉素肠球菌株广泛流行，这些耐药株的出现和传播使屎肠球菌所致重症感染治疗已成为临床棘手的问题之一[1-2]。因此不断发现对屎肠球菌感染治疗有效药物是目前紧迫的问题之一。

既往文献已证实新型四环素药物替加环素是治疗屎肠球菌感染的新型药物选择之一[3]。近年刚获FDA批准的Eravacycline是新型的四环素类抗生素，其结构类似于替加环素，研究表明该药物可克服四环素耐药基因导致的药物敏感性下降，有文献认为包括了外排泵（tetA、tetK、tetL）及核糖体保护蛋白（tetM、tetO、tetS）等耐药机制均不影响Eravacycline的药物敏感性[4]。尽管有研究显示屎肠球菌四环素的耐药率超过60%，Eravacycline对屎肠球菌的具有较好的体外活性[5]，能较好克服tet抗性基因导致的耐药，然而我国鲜见屎肠球菌Eravacycline药物敏感性研究报道[6]。因此本文研究Eravacycline对我国屎肠球菌的体外敏感性，我国屎肠球菌tet抗性基因分布及对Eravacycline敏感性的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株收集 本研究共收集屎肠球菌株235株临床分离株（2011年1月-2018年12月），包括深圳市南山区人民医院收集122株临床分离株和哈尔滨医科大学附属第四医院收集的113株（排除同一患者同一部位重复标本），菌株均在30%甘油保存于-80 ℃。菌株分离来源于各种临床标本，包括血液、尿液及胆汁和大便等。

1.2 菌株的复苏、鉴定及MIC值检测 经甘油-80 ℃保存，实验菌株经血平板接种复苏，质谱仪鉴定。屎肠球菌常用抗生素（氨苄西林，万古霉素，四环素，利奈唑胺，红霉素，环丙沙星，呋喃妥因）药敏由BD phonixtm 100公司全自动药敏鉴定系统进行测定，抗生素折点参考2017年CLSI规定的标准判定耐药（resistance，R），中介（intermediary，I）和敏感（sensitive，S），根据质控菌株ATCC29213质控范围。Eravacycline纯品由MCE提供，其药物敏感性按照CLSI提供的操作方法采用琼脂稀释法测定[7]。

1.3 四环素耐药基因扩增 选择PCR扩增6个四环素特异性耐药基因（tetM、tetL、tetU、tetK、tetS和tetO），引物由北京六合华大基因合成，引物序列参考文献[8]，挑取单克隆菌落加入盛有50 μL DNA裂解缓冲液液（lysis buffer for microorganism to direct pcr）的EP管中，震荡混匀，80 ℃干燥加热15 min，冷却至室温后，12 000 r/min離心5 min，取上清进行PCR检测，反应体系及条件：2×PCR Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，加蒸馏水21 μL补足至50 μL，tet抗性基因退火温度为52 ℃，时间30 s，延伸72 ℃，1 min。扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳确认DNA片段分析。

2 结果

2.1 屎肠球菌药敏和Eravacycline敏感性检测结

果 屎肠球菌临床分离株结果显示，屎肠球菌对氨苄西林、环丙沙星、呋喃妥因、四环素和红霉素具有较高耐药率，对利奈唑胺和万古霉素具有较好敏感性，耐药率分别为0.43%（1/235）和0.43%（1/235），各种抗生素耐药率见表1。Eravacycline MIC值<0.012 5、0.125、0.25和0.5 μg/mL的比例分别为115/235、97/235、20/235和3/235。

2.2 四环素耐药基因分布特点及与Eravacycline敏感性之间关系 结果提示，181株屎肠球菌携带tet抗性基因，其中123株携带了两种以上抗性基因，其中屎肠球菌携带四环素的耐药基因tetM+tetL比例达45.5%（包括tetM+tetL+tetU和tetM+tetL两种组合），携带tetM基因有138株，携带tetL基因136株，携带tetU基因组合的比例为28.57%，携带四环素耐药基因的菌株四环素耐药率显著升高。Eravacycline对携带四环素耐药基因菌株表现出良好的活性，3株Eravacycline MIC值为0.5 μg/mL菌携带tetM基因。单独携带tetM基因菌株中8/22菌株的Eravacycline MIC值超过0.25 μg/mL。屎肠球菌四环素耐药基因，见表2。

3 讨论

屎肠球菌是引起临床感染的革兰阳性菌属重要致病菌，是尿路感染的主要致病菌之一，同时也可以导致败血症、腹腔感染等危重疾病[7-9]。与同科的链球菌相比屎肠球菌耐盐耐碱，在胆汁培养基可生长，与粪肠球菌相比屎肠球菌对培养基要求营养低，菌落圆形或椭圆形，在丰富的培养基可形成菌落大而光滑。屎肠球菌基因组具有 其特殊性，其对多种抗生素表现为先天耐药[10-11]，临床中主要依赖集中有限的几种抗生素（万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺等）作为其主要治疗药物。

本研究结果提示屎肠球菌对万古霉素和利奈唑胺等敏感性较高，但对氨苄西林、环丙沙星、呋喃妥因、四环素和红霉素等具有较高的耐药性，这也以往的报道相一致，提示在临床实践中万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺等仍是临床治疗的可靠药物[12-13]。以往有报道屎肠球菌对万古霉素具有较高的耐药率，本地区的地耐药率提示无万古霉素耐药肠球菌株的广泛流行。利奈唑胺是2001年上市的新型噁唑烷酮类药物，本医院既往报道粪肠球菌具有较高利奈唑胺不敏感率，而本研究表明该药对屎肠球菌有良好的抑制活性，可能在同一地区利奈唑胺对粪肠球菌耐药并不代表其对屎肠球菌敏感性下降。

Eravacycline结构类似于替加环素和四环素，属新型四环素类抗生素，其分子式对其四环素核心D环C7和C9进行两次修饰，其作用机制与四环素类似，主要通过与细菌30S小亚基16SRNA结合，阻止氨基酰-tRNA转运，阻止肽链的延伸发挥抑制作用。四环素耐药基因包括了主动外排机制（tetA、tetK、tetL等蛋白质）和核糖体保护蛋白（tetM、tetO、tetS等蛋白）[14-16]。本研究中Eravacycline对屎肠球菌表现出了良好活性，Eravacycline对氨苄西林、环丙沙星、呋喃妥因、四环素和红霉素耐药菌株均具有较低的MIC值，对利奈唑胺和万古霉素耐药株均具有较好的敏感性。MIC值均≤0.5 μg/mL，包括对利奈唑胺耐药屎肠球菌、万古霉素耐药屎肠球菌及含有四环素耐药基因的屎肠球菌均具有较好的活性。本研究中利奈唑胺耐药和万古霉素耐药屎肠球菌数量较少，因此Eravacycline对该两种多重耐药菌活性仍有待进一步研究证实。