KK鼠料快速建模对KK/Upj-Ay/J小鼠相关指标的影响

王 蕾，吴旭颖，高玉龙，梁 超，邓诗芬，刘云波,2*

(1.北京华阜康生物科技股份有限公司，北京 102202； 2.中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 100021)

KK小鼠是由日本本土小鼠通过近交获得，随后日本学者将基因Ay导入KK小鼠体内，KK-Ay小鼠具有黄色的体毛。Ay基因不仅可影响小鼠的毛色还可以引起代谢紊乱，与肥胖和糖尿病的发生有关。KK-Ay小鼠表型接近于人类Ⅱ型糖尿病早期病变的特征，包括过量饮食、中度肥胖、高血糖、胰岛素抵抗等，是一种广泛应用于Ⅱ型糖尿病和肥胖研究的动物模型[1]，此外该小鼠还可用于研究评价降血糖药及其药理作用的研究。

国内KK/Upj-Ay/J小鼠的生物学特性早在1988年就有报道[2]，国内有报道指出高能量饮食可以促进KK/Upj-Ay/J小鼠血糖和发病率明显增加，胰岛体积明显增加[3]。还有报道指出饲料的营养成分是影响血糖的主要影响因素，此外随着年龄的增长影响其血糖值[4]。高脂饲料常用于快速诱导Ⅱ型糖尿病、肥胖症，本公司研制的具有专利配方的KK鼠料(ZL201110127312.5)，是根据Ⅱ型糖尿病模型动物KK/Upj-Ay/J小鼠的营养需求设计的高脂高糖饲料，尤其适用于KK/Upj-Ay/J小鼠，可明显缩短KK/Upj-Ay/J小鼠的成模周期。KK鼠料快速建模对KK/Upj-Ay/J小鼠相关指标的影响却未见详细报道。本研究旨在补充这方面的不足。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级3周龄KK/Upj-Ay/J小鼠80只[雌、雄各40只，雄性KK/Upj-Ay/J小鼠平均体重为(9.40 ± 1.22) g，雌性KK/Upj-Ay/J小鼠平均体重为(9.56 ± 1.21) g]，随机分为4个实验组，每组20只(雌、雄各10只)，分别为普通饲料组、普通饲料空腹血糖组、KK鼠料组、KK鼠料空腹血糖组。SPF级23周龄C57BL/6 J小鼠6只[雌、雄各3只，雄性C57BL/6 J小鼠体重为(32.33 ± 1.51) g，雌性C57BL/6 J小鼠体重为(29.40 ± 0.73) g]为对照组，饲喂普通饲料。KK/Upj-Ay/J小鼠和C57BL/6 J小鼠均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供[SCXK (京) 2019-0008]。动物实验程序由北京华阜康实验动物管理委员会审批确认符合动物伦理学要求和实验动物保护的相关规定，批准号：IACUC-20190502，实验动物饲养和实验过程中做到实验动物使用的3R原则，并给予实验动物人道关怀。

实验KK/Upj-Ay/J小鼠和C57BL/6 J小鼠均饲养在北京华阜康生物科技股份有限公司隔离环境(隔离器)内[SYXK (京) 2019-0022]，隔离环境为洁净度5级，温度(24 ± 2)℃，相对湿度(50 ± 10)%，换气次数为每小时20次，明暗周期为12 h: 12 h，动物自由采食饮水。从3周开始饲喂，饲喂到23周。

普通饲料组动物饲喂小鼠普通繁殖料，为北京华阜康生物科技股份有限公司生产的60Co辐照灭菌的鼠繁殖料1035[京饲证(2019)06076]。营养指标为粗蛋白23.82%、粗脂肪5.16%、粗灰分7.19%、粗纤维4.62%、钙1.25%、磷0.97%、赖氨酸1.55%、蛋氨酸+胱氨酸0.91%。

KK鼠料组动物饲喂KK鼠料，为北京华阜康生物科技股份有限公司生产的KK鼠料1042[京饲证(2019)06076]，主要营养指标为：蛋白17.5%、脂肪17.9%、碳水化合物48.5%(重量百分比)。

饮用水为酸化过滤自来水(pH=2.7 ～ 3.0)并经高压蒸汽灭菌30 min(121℃)。使用的笼具、垫料、水瓶等物品均经过高压蒸汽灭菌30 min(132℃)，每周更换垫料一次，进出隔离器的物品均应进行消毒处理，操作严格遵守隔离系统规程。

1.2 主要试剂与仪器

75%乙醇；血糖仪(江苏鱼跃牌)、配套试纸、电子天平、剪刀等手术器械。

1.3 实验方法

1.3.1 体重的测定

每周用电子天平称取普通饲料组和KK鼠料组小鼠体重，并做好记录。

1.3.2 血糖的测定

按照实验分组每周进行尾静脉取血3 μL，用血糖仪测量空腹血糖值。空腹血糖需要禁食4 h后再进行检测。统计不同年龄、不同性别对照组与实验组的血糖值。

1.3.3 血清生化的检测

完成饲喂实验后，普通饲料组和KK鼠料组小鼠均禁食12 h，小鼠采血(每组雌、雄各6只)，室温放置30 min，离心3000 r/min，分离血浆。送农大动物医院检测室检测生化指标。生化指标包括谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(CREA)、尿素(UREE)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)。

1.3.4 切片及染色

用10%中性福尔马林溶液固定对照组(C57BL/6 J小鼠)、普通饲料组和KK鼠料组雌性、雄性小鼠(每组雌、雄各3只)的胰腺、肝和肾。送北京康蓝生物技术有限公司病理室进行HE染色和特殊染色(胰腺进行胰岛素免疫组化染色、肝进行PAS染色、肾进行PASM染色)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 KK鼠料对KK/Upj-Ay/J小鼠体重的影响

由表1可见在4 ～ 23周饲喂过程中，KK鼠料显著促进雄性和雌性KK/Upj-Ay/J小鼠的增重(P<0.01)。3周时KK/Upj-Ay/J小鼠刚离乳，经过KK鼠料饲喂1周后，显著增加了小鼠的体重(P<0.01)。

表1 KK鼠料对KK/Upj-Ay/J小鼠体重的影响

注：与同性别同周龄小鼠比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the mice of the same sex and age,*P<0.05,**P<0.01.

2.2 KK鼠料对KK/Upj-Ay/J小鼠空腹血糖值的影响

由表2可见KK鼠料饲喂KK/Upj-Ay/J小鼠能显著增加雌性和雄性KK/Upj-Ay/J小鼠的空腹血糖值(P<0.05)。但是显著性差异存在一定的周龄跳跃性，例如对于3周雌鼠、5 ～ 6周雄鼠、7周雌鼠、8周雄鼠、9周雌鼠等的空腹血糖值就没有明显的差异(见表2)，可能与小鼠进食时间的随机性有关。

2.3 KK鼠料对KK/Upj-Ay/J小鼠血清生化指标的影响

由表3可以看出KK鼠料明显增加血清中谷丙转氨酶(P<0.05)，显著增加雄性KK/Upj-Ay/J小鼠血清中胆固醇的含量(P<0.05)，但是对于雌性KK/Upj-Ay/J小鼠血清中胆固醇含量没有显著的影响。KK鼠料可显著增加雌性KK/Upj-Ay/J小鼠血清中肌酐的含量(P<0.05)；此外KK鼠料可增加雄性KK/Upj-Ay/J小鼠血清中总甘油三酯的含量(P>0.05)，但是对于雌性KK/Upj-Ay/J小鼠血清中总甘油三酯的含量影响不大(P>0.05)。

表2 普通饲料或KK鼠料饲喂KK/Upj-Ay/J小鼠空腹血糖数据统计结果

注：与同性别同周龄小鼠比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the mice of the same sex and age,*P<0.05,**P<0.01.

表3 普通鼠料或KK鼠料饲喂KK/Upj-Ay/J小鼠血清生化指标统计结果

注：与同性别小鼠比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the mice of the same sex,*P<0.05,**P<0.01.

2.4 KK鼠料对组织器官组织结构的影响

如图1所示，饲喂实验后，取各组小鼠的胰腺、肝、肾进行病理组织切片分析，发现饲喂两种鼠料对雌雄KK/Upj-Ay/J小鼠胰腺组织结构的影响是相似的，对于雄性的KK/Upj-Ay/J小鼠的胰腺组织没有明显的影响，腺泡、导管和胰岛结构清晰可见，未见明显病变。但是对于雌性KK/Upj-Ay/J小鼠胰腺组织有明显的影响，主要为胰岛细胞增多，体积变大[5-6]。免疫组织化学的结果也显示雌性小鼠普遍存在胰岛素分泌量增多的情况，如图1中C1 ～ F1。

注：A、A1：C57BL/6 J(雌)；B、B1：C57BL/6 J(雄)；C、C1：普通饲料组(雌)；D、D1：普通饲料组(雄)；E、E1：KK鼠料组(雌)；F、F1：KK鼠料组(雄)。A ～ F为HE染色；A1 ～ F1为胰岛素免疫组化染色。标尺=100 μm。图1 两种鼠料对KK/Upj-Ay/J小鼠胰腺组织结构和功能的影响(× 100)Note. A and A1, C57BL/6 J (female). B and B1, C57BL/6 J (male). C and C1, Common feed group (female). D and D1, Common feed group (male). E and E1, KK feed group (female). F and F1, KK feed group (male). A-F, HE staining. A1-F1, Insulin IHC staining. Bars=100 μm.Figure 1 Histological changes of the pancreatic tissues of KK/Upj-Ay/J mice fed on the two kinds of feeds

两种鼠料对雌雄KK/Upj-Ay/J小鼠肝组织结构的影响略有不同，两组肝主要病理变化为肝细胞脂肪变性，KK鼠料饲喂KK/Upj-Ay/J小鼠组脂肪变性程度更加明显(见图2中A ～ F)；普通饲料饲喂组、KK鼠料饲喂组肝细胞胞浆呈PAS染色阴性(见图2中C1 ～ F1)，有报道称糖尿病KK/Upj-Ay/J小鼠肝中糖原含量明显减少[7]。而C57BL/6 J小鼠对照组肝细胞胞浆紫红色为PAS染色阳性反应(见图2中A1 ～ B1)。

注：A、A1：C57BL/6 J(雌)；B、B1：C57BL/6 J(雄)；C、C1：普通饲料组(雌)；D、D1：普通饲料组(雄)；E、E1：KK鼠料组(雌)；F、F1：KK鼠料组(雄)。A ～ F为HE染色；A1 ～ F1为PAS染色。标尺=100 μm。图2 两种鼠料对KK/Upj-Ay/J小鼠肝组织和功能的影响(× 100)Note. A and A1, C57BL/6 J (female). B and B1, C57BL/6 J (male). C and C1, Common feed group (female). D and D1, Common feed group (male). E and E1, KK feed group (female). F and F1, KK feed group (male). A-F, HE staining. A1-F1, PAS staining. Bars=100 μm.Figure 2 Pathological changes of liver tissues in the KK/Upj-Ay/J mice fed the two kinds of feeds

与C57BL/6 J小鼠相比，普通饲料饲喂组、KK鼠料饲喂组肾病理变化主要表现为肾小管蛋白管型，间质性肾炎，血管周围炎，肾小球系膜基质增多，KK鼠料饲喂组肾病变程度较明显(见图3中A ～ F)。C57BL/6 J组肾小球基底膜有明显深棕色物质沉着，而普通饲料饲喂组、KK鼠料饲喂组肾小球基底膜均未见明显棕色物质沉着(见图3中A1 ～ F1)，说明饲喂实验后期肾小球基底膜结构损坏。

3 讨论

KK鼠料可显著地增加雌性和雄性KK/Upj-Ay/J小鼠的体重，如表1所示(P<0.05)，由于KK鼠料中有较高的碳水化合物(占饲料的48.5%)和脂肪(占饲料的17.9%)，能使KK/Upj-Ay/J小鼠快速增重。而且在饲养实验后期雌性KK/Upj-Ay/J比雄性KK/Upj-Ay/J体重增加更明显，本研究与Iwatsuka等人[8]研究雌、雄KK-Ay小鼠在10周和16周的体重，雌性比雄性重的结论一致。此外，该报道称16周KK-Ay小鼠脂肪组织对胰岛素的敏感性降到最低，黄色肥胖基因不仅诱导KK-Ay小鼠肥胖，而且加速了KK-Ay小鼠糖尿病性状的发育，幼年KK-Ay小鼠脂肪合成的活性很强，由于KK-Ay小鼠的代谢特点，导致体内更容易堆积脂肪，而肥胖诱发糖尿病[8]。

KK鼠料可以显著增加雌性和雄性KK/Upj-Ay/J小鼠的空腹血糖值，如表2所示(P<0.05)。与郭清华等[3]研究的高能量饮食可使KK-Ay小鼠的血糖和糖尿病发病率明显增加的结论一致，此外有研究报道指出KK-Ay小鼠的血糖值随着年龄的增长而增加，到16周有巨大变化[8-9]。国内也有相关研究报道，遗传背景相同的情况下，饲料中营养成分脂肪的含量可影响KK/Upj-Ay/J品系A/a杂合子小鼠的血糖值[4]。

KK鼠料饲喂实验后剖检可见KK鼠料组雌性和雄性KK/Upj-Ay/J小鼠肝脂肪变性，色浅而且肥大，质脆。血清生化指标检测也显示谷丙转氨酶显著增加(P<0.05)，谷草转氨酶增加，但是差异不显著。这与脂肪肝患者ALT、AST指标明显上升的报道是一致的[10]。从病理切片和肝PAS染色也显示KK鼠料促进KK/Upj-Ay/J小鼠肝细胞的脂肪变性，促进Ⅱ型糖尿病快速成模，肝细胞PAS染色阴性，与糖尿病小鼠肝细胞PAS染色阴性的报道一致[7]。

两种鼠料饲喂实验末期，雌性KK/Upj-Ay/J小鼠胰腺病变发生，胰岛细胞增多，体积变大。这与胰岛细胞代偿性的分泌胰岛素有关[3, 8]。但是雄性KK/Upj-Ay/J小鼠却不同，胰腺未见明显的病变发生。可能与雄性KK/Upj-Ay/J小鼠生理因素有关，有待进一步研究。日本有学者研究黄化KK-Ay小鼠血糖和循环胰岛素水平从5周龄开始逐渐升高，且胰腺也有年龄依赖性改变，即胰岛B细胞脱颗粒和糖原浸润，第一次观察于5周龄，随后出现胰岛肥大和中央空化[8]。

两种鼠料饲喂实验末期，雌性和雄性KK/Upj-Ay/J小鼠均发生糖尿病肾病，肾组织病变为肾小管蛋白管型，间质性肾炎，血管周围炎，肾小球系膜基质增多。KK鼠料组较普通饲料组肌酐显著增加，雌性KK/Upj-Ay/J小鼠差异显著(P<0.05)。肾PASM染色显示普通饲料组和KK鼠料组饲喂后期肾小球基底膜结构损伤严重，可能与糖尿病肾病肾小球基底膜成分改变有关[11]。有报道指出12周龄进入早期的糖尿病肾病(DN)，20周龄肾脏病理表现为特征性DN改变[12]。16周龄的小鼠也发现了类似于人类糖尿病弥漫性或渗出型肾小球硬化病变[8]。还有报道指出KK-Ay小鼠胰岛素抵抗和高尿微量白蛋白水平可作为糖尿病肾病早期模型诊断[9]。

本研究进一步探讨了高脂料快速建模对KK/Upj-Ay/J小鼠相关指标的影响，为科学研究提供快速建模的数据支持。