乳头瘤病毒感染小鼠模型的研究进展

李 丹，王 卫

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室，国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持续感染可导致宫颈癌等多种疾病。截至2018年5月，乳头瘤病毒基因组数据库(PaVE)已收录乳头瘤病毒(papillomavirus，PV)基因型400种，其中193种为人乳头瘤病毒[1]。针对HPV感染的预防，目前已有三种批准上市的疫苗，分别为二价、四价和九价HPV疫苗。虽然现有HPV疫苗可有效预防大多数引起宫颈癌病变的HPV感染[2-3]，但目前尚无针对HPV感染后病变或引起恶性肿瘤的有效治疗方法。

1 乳头瘤病毒及感染模型

乳头瘤病毒为无包膜双链DNA病毒，可感染哺乳类、鸟类及爬行类动物的粘膜和/或皮肤上皮细胞，并引起良性或恶性肿瘤[4-5]。1983年首次发现人乳头瘤病毒[6]。大部分HPV感染皮肤主要引起良性病变或疣，例如HPV 1型和HPV 2型感染导致足底病变，而HPV 2型和HPV 4型可引起手上常见的疣[7]。约40种HPV可通过性传播感染肛门或/和生殖器区粘膜，如HPV 6型及HPV 11型感染可引起生殖器疣或其它病变[8-9]。根据引起的临床表现不同，HPV又分为高危型HPV(high risk human papillomavirus，HR-HPV)和低危型HPV(low risk human papillomavirus，LR-HPV)。持续感染的HR-HPV可使宿主细胞发生变化，导致肛门或/和生殖器或其它部位癌症。研究证明HR-HPV感染可引起约5%的人类癌症，包括宫颈癌、皮肤癌、口腔癌、肛门癌等[10-14]。

由于宿主特异性，HPV只能感染人，不能感染其它动物，这就限制了HPV感染动物模型的研发。1933年，Shope等[15]在棉尾兔中发现了一种乳头瘤病毒，称之为Shope乳头瘤病毒或棉尾兔乳头瘤病毒(cottontail rabbit papillomavirus，CRPV)。然而，家兔不是CRPV感染的天然宿主，在感染部位只能检测到极低表达水平的病毒感染。随后，陆续发现了犬口腔乳头瘤病毒(canine oral papillomavirus，COPV)、牛乳头瘤病毒(bovine papillomavirus，BPV)等，这些病毒感染动物模型的建立为HPV的感染过程、生命周期和发病机制以及在疫苗评价方面做出了重要贡献[16]。但由于这些动物体积较大，且其生物学、遗传学、免疫学与人类差别过大，以及实验试剂局限等原因，限制了这些感染模型的应用。因此，迫切需要建立小动物模型，从而有效支撑HPV相关疾病的研究。

2 MmuPV1病毒及基因组结构

1989年，Tilbrook等人[17]从经紫外线照射的无毛小鼠的肿瘤组织中鉴定出小鼠乳头瘤病毒DNA，但并未对此病毒进行分离或基因测序。2011年印度科学家从感染的NMRI-Foxn1nu/nu裸鼠上分离得到小鼠乳头状病毒(mouse papillomavirus type 1，MmuPV1)，该病毒可感染实验小鼠，首次提供可用于乳头瘤病毒小鼠模型制备的病毒[18]。

与HPV一样，MmuPV1也是环状双链DNA，其基因组长度为7510 bp，至少编码7个开放阅读框(ORFs)，基于其在病毒基因组内的保守序列，以及与其它乳头瘤病毒长度相当的ORF，MmuPV1基因分别命名为E1、E2、E4、E6、E7、L1及L2，分为早期编码区(包含E1、E2、E4、E6与E7基因)和晚期编码区(包含L1与L2基因)两种。早期编码区分子负责病毒复制、转录及翻译，与多个宿主基因相互作用，并导致细胞恶性转化，促进肿瘤的发生。其中，MmuPV1 E1和E2分子与其它乳头瘤病毒一样，是病毒DNA复制和转录关键因子[19-20]。HPV研究表明，E5、E6和E7分子可刺激感染的细胞增殖，并调节角质形成细胞分化，是主要的致癌基因。β-HPV可能因缺乏E5 ORF而使其无法引起严重的恶性肿瘤。与β-HPV类似，MmuPV1也无E5 ORF。与皮肤型HPV和某些粘膜低危型HPV类似[21-22]，MmuPV1利用两个独立的早期启动子表达病毒E6(P7503)基因和E7(P360)基因，其中P7503是强启动子。而高危型HPV E6和E7基因的表达是由E6 ORF上游的单个早期启动子表达，而E7基因的表达需要在早期转录物中剪接掉E6基因的内含子。MmuPV1的第三个早期启动子P859，其可能是表达E2和(或)E8^E2基因的弱启动子。Dreer等人[23]研究证明E8^E2作为负调控基因，通过细胞NCoR/SMRT复合物抑制HPV16基因组扩增。同时，MmuPV1有两个晚期启动子，P7107(在L1 ORF下游的LCR区域内)和P533(在E7 ORF内)[24]。确定MmuPV1基因组结构及病毒基因表达图谱，有助于了解导致乳头瘤病毒感染机制和相应病毒基因的致病机制。

3 MmuPV1感染及其机制

多家实验室报道，MmuPV1感染免疫健全的小鼠品系不会引起相应的乳头状瘤病，如BALB/c、FVB/NJ和C57/BL6等[18, 25-27]。但MmuPV1感染免疫缺陷小鼠却可导致乳头状瘤病，免疫健全小鼠品系在免疫抑制后，如注射免疫抑制药物环孢菌素、照射UVB(ultraviolet B)和注射抗CD3抗体，感染MmuPV1也可出现乳头状瘤症状[25-26, 28]。基因编辑动物的实验结果也支持该结论，MmuPV1感染携带FoxN1nu/nu突变基因的小鼠，其病变区组织病理学分析显示，与PV相关疾病特征一致，即具有PV特异性抗原阳性的空泡细胞乳头状突起[18]。不同转基因或基因敲除而导致免疫缺陷的小鼠品系研究中发现，T细胞缺失对于MmuPV1的自然感染至关重要，而MmuPV1不能感染仅缺失B细胞的小鼠品系[29]。但尚不明确何种T细胞亚群在其中发挥主要作用。Handisurya等人[26]利用抗体耗竭C57BL/6小鼠与SENCAR小鼠CD4+或CD8+T细胞后感染MmuPV1，发现缺失CD4+或CD8+T细胞的SENCAR小鼠均可产生乳头瘤病变，但缺失CD4+或CD8+T细胞的C57BL/6小鼠未发现病变。其他研究人员也得到类似结论[29-30]。

此外，小鼠品系也对MmuPV1的致瘤具有影响，见表1。SHO-PrkdcscidHrhr小鼠可感染MmuPV1，并在多处组织器官出现继发感染[30]。然而，NOD(non-obese diabetic)遗传背景的SCID小鼠感染MmuPV1后并未出现相关的皮肤乳头状瘤[29]。Handisurya等人[26]研究发现，H2单倍型背景对于MmuPV1的易感性并无相关性，如同是H2b单倍型的C57BL/6小鼠和129S6/SvEv小鼠，前者对病毒不易感，而后者易感；同为H2d单倍型的DBA/2NCr小鼠和BALB/cAnNCr小鼠，前者不易感，后者易感。

4 MmuPV1的致病及其机制

参与PV致癌作用最重要的两个基因分别是E6和E7早期基因，目前已发现多个E6和E7的靶基因，其中一些在病毒感染机体后功能性失活，从而导致组织器官病变甚至恶性肿瘤的发生。与其它PV一样，MmuPV1也含有这两种推定的病毒致癌基因，E6和E7基因，两种基因产物在体外研究中表现出显著的增殖活性以及体内致瘤性[34]。系统发育学研究表明，MmuPV1是π属成员，与γ-和β-HPV关系密切[35]。

MmuPV1 E6基因在病毒诱导的裸鼠乳头状瘤中起关键作用[36]，其长度约150个氨基酸，目前已经鉴定出PV E6可与多种细胞内基因结合而发挥功能，如paxillin蛋白[37]、细胞E3泛素连接酶E6AP[36]、核转录激活蛋白家族mastermind-like 1(MAML1)[38-39]及干扰素调节因子-3(interferon regulatory factor-3，IRF3)[40]等。Meyers等人[36]发现MmuPV1 E6基因与HPV8 E6基因作用于相似的靶基因，通过与TGF-β信号传导通路中SMADs(R-SMADs)2和3调节的受体作用，以及与NOTCH信号传导通路的重要共激活因子MAML1基因结合，抑制这两条重要的肿瘤抑制通路。NOTCH和TGF-β肿瘤抑制因子是角质形成细胞分化和空泡细胞形成的关键因素，通过改变细胞周期和驱动角质形成细胞向终末分化，并最终导致细胞死亡。

PV研究中另一个重要的致癌基因是E7基因。通常情况下，细胞发生非程序性增殖时，可通过诱导细胞凋亡来清除增殖的细胞。所以，PV E7就可能诱导细胞的凋亡。同其它致癌型PV E7一样，MmuPV1 E7可结合PTPN14使其降解，PTPN14基因是经典的非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶[41]。MmuPV1 E7基因与γ-HPV197 E7基因相似，均缺少视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)基因结合位点，多种PV E7基因可通过与肿瘤抑制蛋白RB蛋白家族结合进而导致恶性病变[42]。E6和E7基因通常是共同发挥作用，例如逃避免疫系统，这样其中一个基因的变化都会引起另一种基因的改变[43]。这些研究结果推测，MmuPV1 E6和E7基因可能与高危型人乳头瘤病毒E6和E7基因共享致癌特性。

5 MmuPV1小鼠模型的特点及其应用

MmuPV1感染小鼠模型，自首次报道以来，多个科研团队在病毒免疫学、分子生物学等方面取得可观的进展[18, 25-26, 28-33, 36, 44]。其中重要的发现及含义如下。

5.1 首个用于乳头瘤病毒感染口腔、肛门生殖器等粘膜及相关疾病的小动物模型

超过66%的宫颈癌都与HPV的感染有关。现有的HPV预防性疫苗对已致病个体治疗效果不明显，因此，治疗性疫苗的研究至关重要。已有的研究表明，某些免疫健全的小鼠品系可持续性阴道感染MmuPV1，用于治疗性疫苗的测试[45-46]。

HPV有关的口腔癌在年轻男性中呈现上升趋势[47]。因此，迫切需要一种适合研究口腔HPV相关疾病的临床前模型。小鼠舌头、舌根和口咽部都是MmuPV1的感染部位，这表明，MmuPV1感染小鼠模型可作为研究HPV相关口腔癌的理想模型[33, 48]。

表1 MmuPV1感染小鼠品系及解剖部位诱导肿瘤情况的总结

HPV感染的肛门病变病例逐年升高，原因尚不清楚，也无有效的干预措施[49]。MmuPV1可感染肛管，尤其是肛门生殖器的过渡区[50]。因此，MmuPV1感染小鼠模型也是在肛门癌研究中的亟需模型[51]。

5.2 乳头瘤病毒感染引起皮肤相关疾病的小动物模型

某些皮肤癌与HPV的感染有关。并且，经紫外线照射的免疫缺陷和免疫健全小鼠品系，MmuPV1感染皮肤上皮组织后，可产生皮肤疣，甚至癌变[25, 52]。因此，MmuPV1感染小鼠模型可作为PV相关皮肤疾病和癌症进程的一个首选模型。

5.3 乳头瘤病毒相关组织嗜性及继发感染相关疾病的小动物模型

大多数PV具有组织特异性，表现为皮肤或粘膜嗜性。而MmuPV1不但可感染皮肤，也表现出粘膜趋向性[27]。皮肤感染MmuPV1的小鼠不但可以继发感染皮肤，还可继发感染粘膜[30]，而粘膜感染MmuPV1后，也可扩散到各种皮肤部位[31]。HPV可感染男性和女性生殖器，并且，新生儿的复发性呼吸道乳头瘤病就是由于HPV感染而导致[53]，这些继发性病变均是由于原发性病毒脱落引起。上述结果表明，MmuPV1感染小鼠模型不但是皮肤、口腔、肛门生殖器病变、继发感染甚至癌变的理想模型，也有助于伴侣之间病毒的横向传播和母婴的垂直传播[50, 54]研究。

5.4 乳头瘤病毒感染过程中宿主防御机制研究的小动物模型

免疫健全的小鼠品系可在感染MmuPV1后，感染部位可检测到病毒载量，但无可见乳头瘤样病变。而T细胞缺陷小鼠感染MmuPV1后，可产生乳头瘤样病变，甚至演变成肿瘤[29]。而病毒感染清除过程，B细胞虽不直接清除病毒，但产生的体液效应因子帮助T细胞清除病毒及因PV产生的肿瘤[44]。同时，MmuPV1的感染与小鼠品系有关，但相同H2单倍型小鼠品系对病毒的易感性不同。上述研究，有助于我们在不同背景下进行小鼠基因改造，为进一步研究病毒感染中的宿主因素提供帮助。

6 小结

流行病学数据表明，HPV感染与人类某些恶性疾病有关。因此，发展有效的抗HPV疗法是一个重要的医学挑战。现有HPV感染动物模型，包括HPV转基因小鼠动物模型及其它PV病毒感染动物模型等，帮助人们理解了HPV感染宿主后的复制过程，以及病毒感染的疾病表型等。如科学家们利用动物模型确定了HPV E6和E7基因是主要致癌基因。但HPV感染诱发疾病，同时需要其它诱导因素，如遗传易感性、烟草、雌激素耗竭、辐射以及免疫抑制等，有待进一步研究。因此，还需要加强HPV感染动物模型的研究工作。

鉴于乳头瘤病毒嗜性和宿主免疫抑制，理想的HPV感染动物模型研究存在诸多困难。在科学家的努力下，构建了数个HPV的参比动物模型，如牛、狗、兔等PV感染模型，但其成本较高和技术困难限制了模型的进一步应用。新分离得到的MmuPV1能感染小鼠，是非常有价值的乳头瘤病毒，可用于PV病毒感染及相关疾病机制研究，为HPV的感染及致病机制研究提供了更多的机会。