乙酸改性苎麻纤维固定化微生物的石油污染修复研究

田秀梅，王晓丽，彭士涛，，赵俊杰，王旭，邱滨滨

(1.天津理工大学 环境科学与安全工程学院，天津 300384；2.交通部天津水运工程科学研究所 水路交通环境保护技术交通行业重点实验室，天津 300456)

溢油事故严重制约了海洋生态平衡和经济发展[1-2]。从现有的海洋溢油清理技术来看，微生物固定化技术因能克服菌体流失、与浮油接触较难等弊端而备受关注[3-6]。在固定化技术应用中，生物载体的选择至关重要。载体的生物相容性、疏水性、吸附性和可浮性是去除石油烃的关键[7-9]。本研究选择部分老龄、副产品苎麻纤维废弃物为载体，进行乙酸改性，然后将其应用于固定化微生物技术中不仅可以实现海洋污染修复，还能达到废弃物资源化利用。通过研究乙酸改性苎麻纤维固定化石油降解菌群的降解性能，为实际海洋溢油污染修复提供技术支持。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

高效石油降解菌：醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、威尼斯不动杆菌(Acinetobactervenetianus)、红球菌(Rhodococcussp.)均为自制，将4株菌扩大培养后按2∶2∶2∶4的体积比混合成混合菌液。

培养基：①无机盐培养基(MSM)：NaCl 0.5 g、KH2PO41.5 g、K2HPO41.5 g、NH4NO33.0 g、Mg2SO4·7H2O 0.1 g，FeCl20.01 g、CaCl20.01 g；蒸馏水1 000 mL，初始pH为7.2±0.2。②固定化培养基：NaCl 5 g、牛肉浸膏5 g、蛋白胨10 g，去离子水1 000 mL，pH为7.2±0.2。

SU3500扫描电子显微镜；UV9600紫外分光光度计；TENSOR37傅里叶红外光谱仪；GC-2010型岛津气相色谱仪。

1.2 乙酸改性苎麻纤维[10]

将20～40目的苎麻纤维置于500 mL的圆底烧瓶中，加入一定浓度的乙酸改性剂，油浴加热100 ℃，恒温回流2～6 h，磁子转速60 r/min。加热后，用蒸馏水将苎麻纤维清洗至中性，60 ℃鼓风干燥，得到乙酸改性的苎麻纤维。

1.3 吸附法固定微生物

称取0.5 g苎麻纤维倒入50 mL固定化培养基中，121 ℃、30 min灭菌。取5 mL混合菌液接至固定化培养基中温育，30 ℃、170 r/min下振荡培养36 h。4 000 r/min、30 ℃条件下离心固定化载体10 min，倾去上清液，加入生理盐水清洗3次，得到固定化菌剂。通过SEM、FTIR分析载体特征及微生物附着生长情况。

1.4 游离和固定化菌对原油的去除

用二氯甲烷萃取MSM介质中的残余原油，用紫外-可见分光光度法测定原油总去除率。过滤提取生物载体上吸附的原油计算吸附率。生物降解率为总去除速率减去吸附率。

1.5 不同环境因素对游离和固定化菌的降解影响

测定游离和固定化菌在不同温度(15，20，25，30，35 ℃)、pH值(4，5，6，7，8和9)、盐度(15‰，20‰，25‰，30‰和35‰)条件下培养7 d后的生物降解率，每个处理重复3次。

1.6 游离和固定化菌对正构烷烃的降解

使用气相(GC-FID)测定烷烃的去除率。GC-FID检测条件：载气为高纯氮，进样口和FID温度分别为290，300 ℃。进样量1 μL，手动进样，不分流。峰面积归一化法定量分析烷烃的残留量，计算如式(1)所示：

(1)

式中Ci——某烃组分的质量分数，%；

Ai——某烃组分的峰面积；

fi——某烃组分的质量校正因子。

2 结果与讨论

2.1 游离和固定化菌对原油去除

以未改性和乙酸改性苎麻纤维为载体，固定化菌和游离菌群的原油去除效果见图1。

图1 吸附固定菌对原油的去除Fig.1 Oil removal rate of petroleum bacteria immoblized by sorption

由图1可知，未改性和乙酸改性固定化菌的总去除率分别为83.74%和96.39%。培养7 d后，生物降解原油发挥主要作用。与游离菌(66.73%)相比，固定化菌的生物降解率显著提高，固定化菌在改性前后的生物降解率分别为77.37%和85.16%。改性前后苎麻纤维载体的吸附去除率仅为6.34%，11.23%，这表明即使生物载体是一种优异的吸附剂，但当其与生物技术结合时，吸附更多的是起到协同生物降解的作用[11]。通过吸附固定的方式能够有效地提高生物降解率，维持较高的总去除率。

2.2 载体及固定化菌的微观结构分析

2.2.1 FTIR分析 苎麻纤维改性前后的红外光谱图见图2。

图2 改性前后苎麻纤维FTIR图Fig.2 The FTIR spectra of crude ramie fiber and modified ramie fiber

2.2.2 SEM分析 苎麻纤维载体及固定化微生物的SEM见图3。

图3 改性前(a)、改性后(b)、固定化菌剂(c、d)样品的扫描电镜图Fig.3 SEM micrograghs of raw，modified samples and immobilized bacteria

由图3a可知，原始苎麻纤维表面平滑，结构规则平整、致密，而乙酸改性后的苎麻纤维表面粗糙、疏松，有丰富的孔隙结构(图3b)。这为微生物的生长、代谢和固着提供有利条件。乙酸改性的苎麻纤维能将微生物吸附在中空纤维素管内部及缝隙间，形成高浓度菌群。混合菌群成团状生长，菌体形态均匀，且细胞自身产生的胞外聚合物增强了对载体材料的粘附，活性未受到影响，说明载体有良好的生物亲和性。因此，选择乙酸改性的苎麻纤维为固定载体。

2.3 不同环境因素对游离和固定化菌的降解影响

环境温度、pH、盐度对游离菌与固定化菌降解影响见图4。

图4 不同环境因素对游离和固定化菌的降解影响Fig.4 Effects of different environmental factors on the degradation of petroleum by free and immobilized bacteria

由图4a可知，游离和固定化菌在30 ℃时均具有最高的油降解水平，分别为67.75%，86.91%。游离和固定化菌的油降解合适温度范围分别为25～30 ℃和25～35 ℃，表明固定化菌的温度范围比游离菌群的温度范围宽。此外，低温条件下，固定化菌对石油的降解效率明显较高(图4a)。固定菌的降解速率的变化不如游离菌群那么敏感，这说明载体一定的隔热保温作用能使固定化菌更好地适应温度的变化。

由图4b可知，pH为5～8时，固定化菌和游离菌群的降解趋势相对稳定。但当pH升至9.0时，游离菌群的降解效率迅速下降了19%，细菌的降解活性受到抑制。相反，固定化菌保持良好的原油降解效果，这表明固定化细菌对碱性条件的耐受能力优于游离菌。

由图4c可知，在本研究范围内，盐度对游离和固定化菌降解原油的影响很小。总体来说，随盐度含量的变化，原油降解呈先上升后降低的趋势。当盐度为30‰时，游离和固定化菌的降解效果最好，分别为72.45%，87.44%。

2.4 游离和固定化菌对烷烃的降解

图5为游离菌群和固定化菌对原油的降解情况。

图5 原油成分气相色谱图Fig.5 Gas chromatograms of crude oila.空白对照；b.游离菌；c.固定化菌

由图5可知，游离菌和固定化菌对原油成分有不同程度的降解。游离与固定化菌对烷烃降解后含量变化见图6。

图6 游离和固定化菌对烷烃的降解Fig.6 Degradation of n-alkanes by free and immobilized bacteria

由图6可知，固定化菌对烷烃的降解效果远高于游离菌，7 d后游离和固定化菌对烷烃的平均降解率为67.86%，86.28%。这归因于苎麻纤维吸附原油增加了与细菌的接触面积，并提高了生物降解。此外，固定化菌对短链烷烃(C12～C20)的降解效果最佳(94.85%)，这是因为固定化载体的疏水亲油性增加了对石油烃的吸附，对烷烃起到了富集效果，且短链烷烃相对于中长链烷烃(C27～C37)更容易进入载体内部被微生物摄取，进而提高了对短链烷烃的降解。因此，改性苎麻纤维的疏水吸油性有效地促进了固定化菌剂对浮油的生物降解。

2.5 吸附-协同生物降解假设模型

图7显示了整个吸附-生物降解过程。

由图7可知，当石油污染物在海洋中扩散时，迅速以浮油的形式漂浮在海面上形成疏水层，阻碍了传质过程和微生物的呼吸作用。乙酸改性苎麻纤维载体是吸附剂，将原油吸附到材料的表面及孔隙中，从而控制油的扩散，同时实现油与固定化细菌直接接触。

图7 固定化菌的整个吸附-生物降解过程Fig.7 Whole adsorption-biodegradation process of immobilized bacteria

整个过程主要有两个阶段，第一阶段为主要吸附过程，载体的吸附作用可以短时间内降低海洋中石油浓度；然后进入第二阶段，即生物降解过程。载体上固定的石油降解菌群以石油烃为碳源，最终将石油烃矿化成二氧化碳和水。当二氧化碳和水释放到空气和水中时，生物载体的吸附能力又可以恢复。结果，两个阶段的协同作用形成了短暂的动态平衡，这与Wang等提出的吸附-协同生物降解模型一致[15]。

3 结论

(1)乙酸改性苎麻纤维固定菌比游离菌群对原油去除率更高，7 d后，固定化菌的生物去除率为85.16%。

(2)SEM及FTIR分析显示，乙酸改性的苎麻纤维原始结构发生变化，具有良好的疏水性，增强了对石油烃污染物的吸附。改性载体具有良好的生物亲和性，且细菌自身产生的胞外聚合物增强了对载体材料的粘附。

(3)在不同的环境因素(温度、pH、盐度)，固定化菌比游离菌表现出更好的环境耐受性。GC-FID显示，固定化菌对烷烃的降解远高于游离菌群，特别是链长(C12～C20)的短链烷烃降解率高达94.85%。

(4)提出的吸附-协同生物降解假设模型，充分说明乙酸改性苎麻纤维吸附固定微生物去除原油是一种很有前途的油污修复方法。