超高效液相色谱—串联质谱法测定炒货中纽甜含量的不确定度评定

黄 坤 王会霞 范小龙 郭 嘉

(1. 湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430075；2. 湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北 武汉 430075；3. 绿色化工过程教育部重点实验室，湖北 武汉 430205)

纽甜属于新型的强力功能性甜味剂，甜度约为蔗糖的12 000倍，其能量低、甜味柔和、无明显异味，且高温条件下稳定性能十分优异，因此被广泛应用于各类食品的生产过程中[1-4]，以改善口感和风味。测量不确定度是指根据所用到的信息表征赋予被测量值分散性的非负参数，是与测量结果紧密相关的参数，因此完整的测量结果应同时包含被测量值及其测量不确定度[5]。目前食品中纽甜含量的测定大多采用高效液相色谱法，关于其不确定度的评定较少[6-8]，而采用超高效液相色谱—串联质谱法测定结果的不确定度评定更少。为评估此方法的不确定度，研究拟参考相关文献[9-11]，以已添加纽甜的市售葵花籽阳性样品为例，对炒货中纽甜的测定不确定度进行分析评定，确定有关不确定度分量的贡献，在实际检测过程中可对重点过程进行控制，以此保证测定结果的准确度和可信度，同时为其他甜味剂测定结果的不确定度评定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纽甜：≥98.0%，有效期至2020年4月，德国DR公司；

炒货：实验室抽检样品，包括市售瓜子、坚果和果仁等。

乙酸锌、亚铁氰化钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

乙腈、甲醇、甲酸：色谱纯，德国Merck公司；

超纯水：电导率≤0.055 μS/cm，25 ℃，自制；

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱—串联质谱仪：TQS型，美国Waters公司；

电子天平：ME2002E和XS204型，梅物勒-托利多仪器(上海)有限公司；

翻转混匀器：Trayster型，德国IKA公司；

超声波清洗仪：P300H型，德国Elma公司；

高速离心机：Allegra X型，美国Beckman Coulter公司；

全自动固相萃取系统：Preval SPE 6S型，北京普立泰科仪器有限公司；

C18固相萃取柱：Sep-pak型(6 mL、500 mg)，美国Waters公司；

氮吹仪：N-EVAPTM112型，美国Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理 称取样品10 g左右置于50 mL离心管中，加入约30 mL水，翻转混合0.5 min，于50 ℃水浴条件超声处理10 min，冷却后加乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各2 mL，混匀，于4 000 r/min离心5 min，转移上清液至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀后过滤待用。准确移取10 mL滤液通过固相萃取柱，待液面降至柱床时，用5 mL水淋洗，弃去流出液，再用6 mL甲醇分两次洗脱并收集净化液至离心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，准确移取2 mL初始比例流动相涡旋复溶0.5 min，过0.22 μm 微孔滤膜，续滤液视实际情况稀释一定倍数后供超高效液相色谱串联质谱仪分析。

1.3.2 液相色谱条件 C18色谱柱：50 mm×2.1 mm，1.7 μm；流动相：0.1%的甲酸水—乙腈，流速0.3 mL/min；梯度分析程序：0～0.3 min，乙腈5%；0.3～0.8 min，乙腈5%升至65%；0.8～3.2 min，乙腈65%升至95%；3.2～3.3 min，乙腈95%；3.3～3.4 min，乙腈95%降至5%；3.4～5.0 min，乙腈5%；柱温40 ℃；进样量2 μL。

1.3.3 质谱参数 选择ESI离子源负离子模式，电喷雾电压2.50 kV，脱溶剂气流量700 L/h，锥孔气流量50 L/h，离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度350 ℃。多反应监测扫描(MRM)采集参数见表1。

表1 纽甜的质谱采集参数†Table 1 Acquisition parameters ofneotame for UPLC-MS/MS

† *定量离子。

1.3.4 数学模型的建立 样品中纽甜的含量按式(1)计算。

(1)

式中：

X——样品中纽甜的含量，mg/kg；

C——样品溶液的浓度，ng/mL；

V——样品定容体积，mL；

m——样品的称样质量，g；

2 不确定度的评定与合成

2.1 不确定度来源分析

从式(1)结合实际测定过程可知，纽甜测定结果不确定度urel(X)的主要来源包括：① 样品溶液浓度引入的不确定度urel(C)；② 样品溶液定容及稀释引入的不确定度urel(V)；③ 样品称样过程引入的不确定度urel(m)；④ 测量重复性引入的不确定度urel(x)；⑤ 回收率引入的不确定度urel(R)。

2.2 不确定度评定

2.2.1 样品称样过程引入的相对标准不确定度urel(m)

其不确定度主要来源于重复性和天平的校准。

试验中样品的平均称样量为10.012 5 g，因此由样品称量引入的相对标准不确定度为：

2.2.2 样品溶液浓度引入的相对标准不确定度urel(C)

其不确定度主要来源于标准溶液配制和标准曲线拟合。前者包括储备液的配制、储备液的稀释和标准系列溶液制备3个过程。

(1) 标准储备溶液的配制引入的相对标准不确定度urel(C1)：准确称取11.5 mg纽甜标准品(≥98.0%)，用超纯水超声溶解并定容至100 mL，即得浓度为112.7 μg/mL的纽甜标准储备溶液。

因此，由标准储备溶液配制引入的相对标准不确定度为：

(2) 标准储备溶液的稀释引入的相对标准不确定度urel(C2)：用1 mL单标线吸量管(A级)吸取标准储备溶液1 mL于100 mL单标线容量瓶(A级)中，用超纯水定容至刻度，混匀，即得浓度为1.127 μg/mL中间储备液；用1 mL吸量管吸取中间储备液1 mL于10 mL容量瓶中，即得浓度为112.7 ng/mL的标准使用溶液。采用矩形分布，各量具及温度影响引入的不确定度见表2。

表2 标准储备溶液稀释引入的不确定度Table 2 Uncertainty from the dilution of stock solution

故溶液稀释引入的相对标准不确定度为：

(3) 标准系列溶液配制过程引入的相对标准不确定度urel(C3)：用1 mL分度吸量管(A级)分别吸取标准使用溶液(112.700 ng/mL) 0.5，1.0 mL于10 mL单标线容量瓶(A级)中，用超纯水定容至刻度，摇匀，分别得到5.635，11.270 ng/mL的标准工作溶液；用2 mL单标线吸量管(A级)吸取标准使用溶液2 mL于10 mL单标线容量瓶(A级)中，用超纯水定容至刻度，摇匀，即得22.540 ng/mL 的标准工作溶液；用5 mL分度吸量管(A级)分别吸取标准使用溶液3，5 mL于10 mL单标线容量瓶(A级)中，用超纯水定容至刻度，摇匀，分别得到33.810，56.350 ng/mL的标准工作溶液；用10 mL分度吸量管(A级)吸取标准使用溶液8 mL于10 mL单标线容量瓶(A级)中，用超纯水定容至刻度，摇匀，即得90.160 ng/mL 的标准工作溶液；直接将标准使用溶液作为112.700 ng/mL的工作溶液。

故由系列溶液配制引入的相对标准不确定度为：

(4) 曲线拟合带来的相对标准不确定度urel(C4)：分别取以上7种不同浓度的标准工作溶液各进样1次，以系列标准溶液的浓度C对色谱峰面积作曲线，采用线性最小二乘法拟合得到回归方程Y=A1C+A2(A1为斜率，A2为截距)，测定数据及计算结果如表4所示。由2.2.1、2.2.3和2.2.4可知测定液平均浓度C0为72.189 ng/mL，则由标准曲线拟合所产生的标准不确定度为：

(2)

表3 标准系列溶液制备引入的不确定度Table 3 Uncertainty from the preparation of series standard solutions

表4 标准曲线结果Table 4 Results of standard curve

式中：

A1——标准曲线的斜率，1 791.4；

A2——标准曲线的截距，-175.1；

p——对C0的测定次数，p=6；

n——标准工作溶液的测试次数，n=7；

综上所述，由样品溶液浓度引入的相对标准不确定度为：

urel(C)=

2.2.3 样品溶液定容及稀释引入的相对标准不确定度urel(V) 因2.2.4中测量重复性引入的标准不确定度已包含样品溶液的定容及稀释过程，故不再另行评定。

2.2.4 测量重复性引入的相对标准不确定度urel(x)

取同一样品，按1.3.1方法，1.3.2和1.3.3条件对其中纽甜的含量进行6次平行测定(n=6)，结果见表5。

表5 重复性试验结果Table 5 Results of repeatability test

2.3 合成相对标准不确定度

样品称样量、样品溶液的浓度、测量重复性和回收率等分量彼此之间相互独立，将各不确定度分量合成，即得纽甜测定结果的合成相对标准不确定度:

0.045 90。

各相对标准不确定度分量的贡献值见图1。

图1 各相对标准不确定度分量的贡献Figure 1 Contributions of relative standard uncertainty components

2.4 扩展不确定度

3 测量结果及其不确定度报告

用超高效液相色谱—串联质谱法测定炒货中纽甜的含量，测定结果为X=(7.69±0.71) mg/kg,k=2。

4 结论

研究采用超高效液相色谱—串联质谱法测定炒货中纽甜的含量，结果符合相关国标规定的误差要求，不确定度评定过程合理有效。通过分析可知，影响纽甜的测定结果不确定度的因素主要为样品溶液浓度和测量重复性，其次为测量回收率和样品称样量；进一步分析可知样品溶液浓度因素中贡献较大的分量为标准储备溶液的配制和标准曲线的制备。因此在实际检测过程中要尤其关注标准溶液的相关操作过程和样品重复性测定等关键环节，通过增加标准物质的称样量、使用准确度更高的量器、增加平行样品的测定次数、尽量提高测量回收率等措施，同时确保人员操作的规范性和一致性，以此减小测量不确定度，从而保证检测结果的准确性和可靠性。