核桃中血清素的提取分离与抗心肌缺血活性研究

陈 晨 徐德平 金 蒙 张晓娟

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

核桃(JuglansregiaL)又名胡桃、羌桃。中医认为，核桃具有健脑益智，补肾固精，温肺定喘的作用[1]。现代研究发现，核桃还具有抗氧化[2-3]，调节胆固醇，降低血压，预防心脑血管疾病的功效[4-5]，是公认的“黄金圣果”。

有关核桃生理功能的研究报道较多，相对应的功效成分报道却较少，如核桃具有抗心脑血管疾病的功能，大量文献[6-7]表明是核桃油中不饱和脂肪酸起主要作用，但李旭[8]以大鼠高血压为模型，对比脱脂核桃粉和核桃油的作用效果，发现脱脂核桃粉的降血压效果明显优于核桃油，说明脱脂核桃仁中含有抗心脑血管疾病的成分，而有关此成分的研究尚未见报道。

试验拟以脱脂核桃仁为原料，采用多种色谱法分离，通过细胞体外功能评价来寻找核桃中抗心血管疾病的功能成分，旨在明确核桃仁中除油以外预防心血管疾病作用的功效成分，以期为核桃资源的高效利用和深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

脱脂核桃仁：云南省林业科学院；

SD乳鼠：上海实验动物研究中心。

无水乙醇、正丁醇、茴香醛、冰醋酸、甲醇、硫酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

MMT母液：美国Sigma公司；

大孔吸附树脂AB-8型：天津南开大学化学工厂；

MCI填料(100 μm)、ODS-D填料(50 μm)：日本三菱化学公司；

乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)试剂盒：上海铭博生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

双层玻璃提取罐：RAT-100D型，无锡申科仪器有限公司；

真空泵：MP-201型，郑州长城科工贸易有限公司；

旋转蒸发器：R-501型，郑州华特仪器设备有限公司；

CO2培养箱：PYC-30型、96孔板，上海化科实验器材有限公司；

高压灭菌锅：LDZX-75KBS型，苏州赛恩斯仪器有限公司；

倒置显微镜：XDS1C型，上海万衡精密光学仪器厂；

冷冻高速离心机：Eppendorf 5810R型，德国 Eppendorf公司；

色谱仪：WATERS 2690型，美国沃特世公司；

紫外检测器：WATERS 996型，美国沃特世公司。

1.2 试验方法

1.2.1 核桃功能成分的提取 取20 kg脱脂核桃仁，粉碎后过30目筛，每次取10 kg放入提取罐中，按料液比1∶10(g/mL)加入体积分数70%的乙醇，于70 ℃，120 r/min搅拌提取2 h，过滤，滤渣重复提取两次，合并滤液，于70 ℃减压浓缩成浸膏，得 1.82 kg乙醇提取物，冷藏备用。取1.0 kg乙醇提取物，加水溶解至1 L，转移至分液漏斗中，用1 L乙酸乙酯萃取，重复操作4次，将乙酸乙酯相合并于50 ℃减压浓缩至干，得核桃乙酸乙酯萃取物173.1 g。

1.2.2 乙酸乙酯萃取物的分离 取1.2.1中全部乙酸乙酯萃取物，溶解于适量去离子水中，上大孔树脂柱AB-8(10 cm×150 cm)，依次用体积分数为30%，50%，70%乙醇洗脱，每梯度洗脱2 000 mL。将各部分洗脱液减压浓缩，得30%乙醇洗脱物49.7 g，50%乙醇洗脱物38.2 g，70%乙醇洗脱物32.1 g。

1.2.3 大孔树脂柱分离组分的抗心肌细胞缺血活性的测定 取20只新生乳鼠，参照文献[9]的方法制备心肌细胞，平均分为正常对照组、缺血/再灌注模型组与体积分数30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇洗脱物试验组。

(1) 心肌细胞存活率的测定：按照文献[10]配制模拟缺血液。先向缺血液中充入95% N2与5% CO2饱和15 min，置换正常培养基，放入自制密封盒内，再通入95% N2与5% CO2，直至充分排尽盒中原有气体，密封，培养箱中培养4 h，造成心肌细胞缺血缺氧。再灌注时以复氧血液置换缺血液，通入95% O2与5% CO2，培养箱中培养2 h。采用MTT法[11]测定心肌细胞存活率。将细胞转移至96孔板中，每组设置5个复孔，经缺血/再灌注和药液干预后，吸出培养液，细胞用磷酸缓冲液轻轻漂洗3次，再向每孔中加入100 μL含有0.5 g/L MTT母液的溶液，培养4 h，再次吸培养液，转移至暗处操作，依次向每孔中加入二甲基亚砜(DMSO)溶液150 μL，低速振荡10 min，于酶标仪中测吸光度。

(2) 心肌细胞受损程度的测定：采用试剂盒测定心肌细胞酶水平，取每孔内的细胞培养上清液，参照说明书操作，比色法检测细胞上清中LDH、CK的含量。

1.2.4 大孔树脂柱分离的具有抗心肌缺血活性组分的分离 取大孔树脂分离的具有抗心肌缺血活性的50%乙醇洗脱物35 g，用适量去离子水溶解，上MCI Gel柱(5 cm×100 cm，100 μm)，依次用500 mL去离子水清洗，体积分数为45%，50%，55%的乙醇各500 mL梯度洗脱，每梯度收集25支试管，20 mL为一试管。洗脱液经薄层色谱(TLC)鉴定，用硫酸茴香醛染色，相同Rf值和显色情况的洗脱液合并，分别得45%，50%，55%的乙醇洗脱物6.5，10.4，5.2 g。

1.2.5 MCI Gel柱分离组分的抗心肌缺血活性检测 按1.2.3的方法对MCI Gel柱分离得到的45%，50%，55%的乙醇洗脱物抗心肌缺血活性进行检测。

1.2.6 抗心肌缺血活性组分分析 采用高效液相色谱(HPLC)对MCI Gel柱分离得到的具有抗心肌缺血活性组分的洗脱物的化学组成进行分析。色谱条件：色谱柱Symetry C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)；流动相：0 min，100%水(含0.2%甲酸)；20 min后，50%甲醇+50%水(含0.2%甲酸)；流速0.3 mL/min；进样量10 μL；紫外检测器波长260 nm。

1.2.7 抗心肌缺血活性单体化合物纯化与结构鉴定 取MCI Gel柱45%的乙醇洗脱物5.8 g溶于适量去离子水中，上样至ODS柱(3.5 cm×100 cm，50 μm)，依次用体积分数40%，45%，50%乙醇梯度洗脱，得两个纯的单体化合物Ⅰ、Ⅱ，分别为153.1，82.3 mg。将Ⅰ、Ⅱ用二甲亚砜(DMSO)溶解后进行1H-NMR、13C-NMR测定。

1.2.8 单体化合物的抗心肌缺血活性作用研究 参照文献[9]的方法制备心肌细胞，平均分为10组：正常对照组、缺血/再灌注模型组、试验组(8组)。对照组为正常培养细胞，模型组经缺血再灌注过程，试验组经缺血再灌注过程后再分别灌注单体化合物Ⅰ、Ⅱ，剂量为50，100，150，200 mg/L。心肌细胞存活率及细胞培养液中LDH、CK含量测定方法同1.2.3。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂柱分离组分的抗心肌细胞缺血活性

由表1可知，各试验组中，体积分数50%乙醇试验组的乳鼠心肌细胞存活率最大，LDH和CK酶含量最低，表现出的抗心肌缺血活性最强，且与模型小鼠存在显著性差异(P<0.01)。而体积分数30%，70%乙醇试验组的细胞存活率、LDH和CK酶含量与模型组相比均无明显差异，说明不含抗心肌缺血活性成分。由此推断核桃乙醇提取物乙酸乙酯萃取物有抗心肌缺血活性，且有效成分位于体积分数50%乙醇洗脱物中，故对体积分数50%乙醇洗脱物进一步分离。

2.2 MCI Gel柱分离组分的抗心肌细胞缺血活性

由表2可知，各试验组中，体积分数45%乙醇洗脱物作用后的乳鼠心肌细胞存活率最大，LDH和CK酶含量最低，表现出的抗心肌缺血活性最强，且与模型小鼠存在显著性差异(P<0.01)。而体积分数50%，55%乙醇洗脱物作用后，细胞存活率、LDH和CK酶含量与模型组相比均无明显变化，说明不含抗心肌缺血活性成分。由此推断经MCI Gel柱分离的45%乙醇洗脱物有抗心肌缺血活性，故对体积分数45%乙醇洗脱物进行成分分析和分离纯化。

表1 大孔树脂柱分离组分对缺血/再灌注心肌细胞存活率及LDH、CK酶含量的影响†Table 1 Effects of separation of different components on macroporous resin column on myocardial cell survival rate and LDH and CK enzyme contents in ischemia/reperfusion

† # 表示与缺血/再灌注模型组比较差异显著(P<0.01)。

表2 MCI Gel柱分离组分对缺血/再灌注心肌细胞存活率及LDH、CK酶含量的影响†Table 2 Effects of MCI Gel column separation components on myocardial cell survival rate and LDH and CK enzyme contents in ischemia/reperfusion

† # 表示与缺血/再灌注模型组比较差异显著(P<0.01)。

2.3 45%乙醇提取物组成成分

核桃抗心肌缺血活性成分存在于经MCI Gel柱分离的45%乙醇洗脱物中，对该洗脱物进行HPLC分析，由图1可知，45%乙醇洗脱物主要由两个峰组成，保留时间分别为1.56，1.94 min，推测该部分主要由两个化合物组成。

图1 45%乙醇洗脱物液相色谱图Figure 1 45% ethanol eluate in HPLC

2.4 核桃中抗心肌缺血活性单体化合物的分离

将MCI Gel柱45%乙醇洗脱物反复上ODS柱，依次用40%，45%，50%乙醇洗脱，直到分离出该组分所含的两个单体化合物Ⅰ、Ⅱ，化合物Ⅰ对应保留时间为1.94 min，化合物Ⅱ对应保留时间为1.56 min。由图2可知，两个化合物的薄层色谱图均呈单一条带。

图2 单体化合物薄层色谱图Figure 2 Thin layer chromatography of compound Ⅰ&Ⅱ

2.4.1 化合物Ⅰ的结构鉴定 化合物Ⅰ为白色无定形粉末，溶于甲醇、乙醇，极易溶于水。ESI-MS得出m/z：178 [M+H]+，化合物Ⅰ分子量为177，表明含有奇数个N元素。

1H-NMR谱可知：δ3.72，2.80含两个各为三分峰的亚甲基，偶合常数皆为6.9，表明两个亚甲基相连；芳香区有4个氢信号，δ6.76(1H，dd，J=2.3，8.7)，δ6.99(1H，d，J=2.3)，δ7.23(1H，d，J=8.7)各含1个氢，由偶合常数可知，其构成一个AMX系统，即苯环上三取代氢；δ6.78的氢为单峰氢。

13C-NMR谱中共10个碳：δ151.5为苯环上连氧碳，判断有-OH基存在，δ127.4，115.4，114.4，105.8为4个-CH上的碳，δ134.5，130.7，113.9为3个季碳。δ64.8，30.4为2个-CH2上的碳，从δ64.8的化学位移来看-CH2上碳连有氧，推断有-CH2CH2OH结构片断。综合分析并参照文献[12]得化合物Ⅰ为5,10-二羟色胺，其碳谱如图3，结构如图4。

图3 化合物Ⅰ碳谱图Figure 3 Carbon spectrum of compound Ⅰ

图4 化合物Ⅰ的结构Figure 4 The chemical structures of compound Ⅰ

2.4.2 化合物Ⅱ的结构鉴定 化合物Ⅱ为白色无定形粉末，溶于甲醇、乙醇，极易溶于水。ESI-MS得出m/z：203 [M+H]+，HR-ESI-MS得出m/z：203.274 7[M+H]+，对应的分子式为C12H14N20。

1H-NMR谱显示：1个双峰甲基δ1.57(J=5.4)，δ4.60 处有1个四重峰质子(J=5.4)，推测甲基与该质子相偶合；δ2.83，3.61处各有2个质子(-CH2)，皆呈三重峰(J=6.4)，表明-CH2相邻；在低场区δ6.78(dd，J=2.4，8.7)，6.91(d，J=2.3)，7.27(d，J= 8.7)各有1个氢，从偶合常数来看，其构成一个AMX系统，即苯环上三取代氢。

13C-NMR谱显示该化合物共有12个碳：其中δ151.0 为苯环上连氧碳，判断苯环上有-OH存在；δ114.4，114.0，104.7为苯环上的3个-CH上的碳；δ133.4，133.3，128.2，106.9为4个季碳；δ51.2为-CH上的碳，从化学位移来看该碳与N元素相连；δ43.1，19.8为两个-CH2上的碳，结合氢谱来看两个-CH2上碳相连；δ43.1的碳可能也与N元素相连，推断有-CH2CH2N 结构片断；δ18.6为甲基。综合分析1H-NMR、13C-NMR和MS的图谱并参照文献[13-14]得出化合物Ⅱ为Shepherdine，其碳谱如图5，结构如图6。

图5 化合物Ⅱ碳谱图Figure 5 Carbon spectrum of compound Ⅱ

图6 化合物Ⅱ的结构Figure 6 The chemical structures of compound Ⅱ

2.5 单体化合物的抗心肌缺血活性

由表3可知，模型组细胞存活率仅为26.45%，同时心肌细胞液中LDH、CK含量显著升高，分别达到45.68%和22.76%，可见缺血/再灌注导致心肌细胞明显损伤。5,10-二羟色胺剂量为50 mg/L时，细胞存活率为59.46%(P<0.05)、LDH和CK含量显著降低(P<0.05)；5,10-二羟色胺剂量为150 mg/L时，心肌细胞存活率高达87.79%(P<0.01)，LDH、CK含量达到最低(P<0.01)，且呈剂量依赖关系；在200 mg/L时，心肌细胞存活率有所下降。表明5,10-二羟色胺对缺血/再灌注造成的心肌细胞损伤具有有效保护作用，150 mg/L时作用效果最佳。Shepherdine组细胞存活率与模型组相当，随着含量升高对缺血/再灌注损伤心肌细胞无明显作用。

表3 化合物Ⅰ、Ⅱ对缺血/再灌注心肌细胞存活率及LDH、CK酶含量的影响†Table 3 Effects of compounds I and II on myocardial cell survival rate and LDH and CK enzyme content in Ischemia/Reperfusion

† * 表示与对照组比较差异显著(P<0.05)；** 表示与对照组比较差异极显著(P<0.01)；# 表示与缺血/再灌注模型组比较差异显著(P<0.05)；## 表示与缺血/再灌注模型组比较差异极显著(P<0.01)。

3 结论

试验利用乙醇提取，乙酸乙酯萃取，多种色谱法分离，采用乳鼠缺血再灌注损伤细胞模型筛选，从核桃中得到了血清素5,10-二羟色胺与Shepherdine两个化合物，其中5,10-二羟色胺对心肌细胞损伤具有良好的保护作用，能够提高细胞存活率，减少心肌细胞培养液上清中心肌酶(LDH、CK)的释放，缓解心肌细胞损伤，表明5,10-二羟色胺是核桃仁中有益于心血管作用的功效成分，进一步表明核桃预防心脑血管疾病作用除多不饱和脂肪酸外，5,10-二羟色胺也是重要的活性成分。

有关5,10-二羟色胺对心血管的作用已有较多的报道[15-16]，研究首次从核桃中分离鉴定出此成分，为核桃抗心血管疾病提供了新的思路。但该成分的量效关系和作用机制尚未明确，有待进一步研究。