安石榴苷对金黄色葡萄球菌毒力因子表达的抑制作用

徐云凤 吴 倩 樊秋霞 王 新 夏效东

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2. 西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；3. 绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川 绵阳 621000)

金黄色葡萄球菌是一类革兰氏阳性兼性厌氧菌，在自然界中广泛存在，对生长环境要求低、环境耐受性强[1]，可污染从农田到餐桌的任何一个环节，给人类健康带来严重的安全隐患。据报道[2]，2011～2016年，在中国由金黄色葡萄球菌导致的食源性疾病爆发案例314起，患病人数5 196人，死亡1人，仅次于副溶血性弧菌和沙门氏菌，位居第3位。在美国，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、弯曲杆菌被认为是污染新鲜农产品的最重要的食源性致病菌[3]。金黄色葡萄球菌能够产生多种毒力因子，例如溶血素、肠毒素、血浆凝固酶、毒性休克综合征毒素等[4-5]。这些毒力因子主要为外毒素和侵袭性酶，或作为胞外蛋白分泌到环境中(包括食品基质)，或作为菌体表面蛋白在细菌侵染宿主的过程中发挥作用[6]。金黄色葡萄球菌致病性的强弱在很大程度上取决于其产生的毒力因子[7]，因此研究如何抑制和降低其毒力因子的表达是一个重要的课题。

近年来，由于抗生素的滥用，导致金黄色葡萄球菌出现了不同程度的耐药性，此外，消费者对合成防腐剂的安全性也存在质疑，很多研究者[8]把目光转移到天然产物，尤其是植物源天然活性物质上。许多植物化合物，如多酚类、萜类以及生物碱等，在体外研究中均被发现具有一定的抑制微生物生长或毒力因子表达的作用[9-10]。因而从植物中探索安全有效的天然产物用于预防和控制食源性致病菌(如金黄色葡萄球菌)具有十分重要的意义。

安石榴苷是石榴皮中重要的生物活性物质。据报道，安石榴苷具有抑菌[11]、抗病毒[12]、抗氧化[13]、抗炎症[14]、抗癌[15]等多种生物活性作用。前期研究[16]表明，安石榴苷对金黄色葡萄球菌表现出良好的抑菌效果，最小抑菌浓度(MIC)为0.25 mg/mL，然而安石榴苷对金黄色葡萄球菌毒力因子的表达影响尚不清楚。试验拟对安石榴苷处理后的金黄色葡萄球菌的溶血活性、凝固酶活性和产肠毒素情况进行测定，并采用反转录实时荧光定量PCR技术检测相关毒力基因的表达情况，以期为金黄色葡萄球菌的控制和安石榴苷的开发利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

安石榴苷：纯度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司；

金黄色葡萄球菌：ATCC 29213，美国模式培养物集存库，保存于-80 ℃冰箱；

胰蛋白胨大豆琼脂培养基、脑心浸液培养基、新鲜无菌脱纤维羊血、冻干兔血浆：北京陆桥技术股份有限公司；

无菌滤膜：0.22 μm孔径，美国Millipore公司；

总肠毒素检测试剂盒：德国R-Biopharm公司；

引物：上海捷瑞生物工程有限公司；

石英砂(二氧化硅)：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；

溶菌酶：20 000 U/mg，美国Amresco公司；

溶葡萄球菌素、琼脂糖：美国Sigma公司；

EasyTaq®DNA 聚合酶：北京全式金生物技术有限公司；

细菌总RNA提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司；

反转录试剂盒、SYBR试剂盒：宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.2 仪器与设备

恒温培养箱：DPX-9082 B-2型，上海福玛实验设备有限公司；

超净工作台：YT-CJ-IND型，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；

冷冻离心机：5804R型，德国Eppendorf公司；

PCR仪：9600型，珠海黑马医学仪器有限公司；

电泳仪：1645050型，美国Bio-Rad公司；

实时荧光定量PCR仪：iQ5型，美国Bio-Rad公司；

台式恒温振荡器：TH2-312型，上海精宏实验设备有限公司；

酶标仪：680型，美国Bio-Rad公司；

超微量核酸分析仪：Nano-200型，杭州奥盛仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化及菌悬液制备 从冰箱取出金黄色葡萄球菌，于胰蛋白胨大豆琼脂平板上活化培养。挑取单菌落于装有脑心浸液培养基的试管中，37 ℃振荡培养12 h。然后用新鲜无菌的脑心浸液培养基将菌悬液的吸光度调至OD600 nm=0.5(含菌量约为108CFU/mL)。

1.2.2 菌落计数 采用梯度稀释法将安石榴苷母液在无菌的10 mL离心管中进行稀释，使其浓度分别为0，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，2 MIC。加入等体积2倍浓度的脑心浸液培养基，使安石榴苷最终浓度为0，1/16 MIC，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，此时培养基的浓度变为1倍正常浓度。将上述菌悬液按照1%(体积分数)的接菌量接入到培养液中，混合均匀，37 ℃，130 r/min 条件下震荡培养24 h后，进行系列10倍稀释，涂板计数。

1.2.3 溶血活性的测定 参照Worlitzsch等[17]的方法测定溶血活性，修改如下：将上述菌悬液按1%的接菌量接入到含有安石榴苷的脑心浸液培养基中，使安石榴苷的终浓度分别为0，1/16 MIC，1/8 MIC，1/4 MIC，1/2 MIC，1 MIC，37 ℃，130 r/min 条件下震荡培养24 h，12 000 r/min 离心5 min，将上清液用0.22 μm孔径的无菌滤膜过滤。取475 μL过滤后的样品上清液于1.5 mL离心管中，加入25 μL 无菌脱纤维羊血，轻摇混匀，37 ℃孵育2 h。3 000 r/min 离心1 min，吸取200 μL上清液，转移到96孔板中，450 nm下测定其吸光值。以不含安石榴苷的菌悬液上清作为阳性对照，以无菌脑心浸液培养基经过同样处理后作为空白对照。

1.2.4 凝固酶效价的测定 吸取0.5 mL无菌生理盐水加入到冻干血浆西林瓶中，摇匀使之充分溶解，再加入上述不同浓度安石榴苷处理的金黄色葡萄球菌培养液0.3 mL，混合均匀后于37 ℃培养箱内静置。在6 h以内，每间隔1 h观察1次结果，若出现凝固现象，即认为待测菌液的血浆凝固酶为阳性，否则为阴性[18]。

1.2.5 总肠毒素的检测 采用三明治(夹心)酶联免疫反应法[19]检测安石榴苷对金黄色葡萄球菌总肠毒素表达量的影响。样品处理方式同1.2.3，取无菌滤液稀释5倍后进行检测。将酶联免疫试剂盒中所有试剂温度恢复至室温，然后于室温下按照试剂盒说明书进行操作。

将所需数量的微孔条插入到框架中，向每个微量滴定孔中加100 μL样品或阳性对照，轻摇混匀，包上封口膜，37 ℃孵育1 h；将液体全部倒掉，在吸水纸上轻轻拍打至倾倒完全，加入300 μL洗涤缓冲液，重复操作5次；加入100 μL酶连接物1溶液，用手轻轻摇动使其混匀，封口，37 ℃再孵育1 h；重复洗涤步骤；加入100 μL酶连接物2溶液，轻摇混匀，封口，37 ℃孵育30 min；再次重复洗涤步骤；加入100 μL底物/发色剂，轻摇混匀，封口，在37 ℃ 下避光孵育15 min；加入100 μL反应终止液，在30 min 内用酶标仪在450 nm处测量每个孔的吸光值。

1.2.6 qRT-PCR法检测毒力基因的表达

(1) 引物序列及特异性检测：引物序列参照Qiu等[20]所使用的序列。取1 mL在脑心浸液培养基中过夜培养的金黄色葡萄球菌菌液，离心(12 000 r/min,2 min)，弃上清液，加入1 mL无菌水后于干浴器中100 ℃ 加热煮沸20 min；4 ℃，12 000 r/min 条件下离心5 min，并取上清液作为PCR反应的模板。反应体系如表1所示，反应条件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、1 min，35个循环；72 ℃、10 min；4 ℃、10 min。取5 μL PCR产物在1 g/100 mL 的琼脂糖凝胶中进行电泳，缓冲溶液为0.5 ×TBE。EB染色后在凝胶成像系统下观察在目标位置有无条带出现，且有无杂带。

表1 PCR反应体系Table 1 PCR reaction system μL

(2) RNA的提取：按天根细菌/细胞RNA提取试剂盒说明进行细菌RNA的提取，由于金黄色葡萄球菌细胞壁比较厚，破碎困难，在操作中加入溶葡萄球菌素处理和石英砂震荡破碎的步骤。

按上述方法进行给药处理，24 h后，取1 mL菌悬液于1.5 mL无RNA酶离心管中(离心管预先装有20～30 mg 石英砂，并高压灭菌处理)，12 000 r/min，4 ℃条件下离心2 min，弃上清，用无菌水洗涤1次；用含3 mg/mL溶菌酶的100 μL TE缓冲液重悬菌体，室温孵育15 min；加入10 μg/mL溶葡萄球菌素3 μL，继续孵育5 min；加入350 μL裂解液，涡旋振荡1 min，冰浴2 min，重复5次，12 000 r/min离心2 min，将上清液转移至另一离心管中；加入250 μL无水乙醇，混匀，转入吸附柱中，余下操作按试剂盒说明书进行，最终得到RNA溶液。用微量核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度和纯度，将RNA的浓度调为一致。

(3) 反转录反应：按照试剂盒说明书进行操作。

(4) RT-PCR：按照试剂盒说明书进行操作。反应条件：95 ℃、30 s，1个循环；95 ℃、5 s， 55 ℃、30 s，72 ℃、 30 s，40个循环(荧光定量)；95 ℃、15 s，1个循环；60～90 ℃、30 s，71个循环(溶解曲线)。

毒力相关基因相对定量结果以16S rRNA作为内参，采用2-ΔΔCt法表示。ΔΔCt按式(1)计算。

ΔΔCt=(Ct4-Ct3)-(Ct2-Ct1)，

(1)

式中：

ΔΔCt——处理组和对照组之间校正过的循环数变化；

Ct4——安石榴苷处理组目的基因的平均Ct值；

Ct3——安石榴苷处理组内参基因的平均Ct值；

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Ct2——对照组目的基因的平均Ct值；

Ct1——对照组内参基因的平均Ct值。

1.3 数据处理

所有试验重复3次，试验结果以(平均数±标准偏差)表示，使用SPSS 19.0统计软件分析和处理数据，采用Tukey法进行差异显著性检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 安石榴苷对细菌生长的影响

通过菌落计数得知，起始接菌量为(3.45±0.17)×106CFU/mL。培养24 h后，每个管内的菌落数如表2所示，随着安石榴苷浓度的增加，金黄色葡萄球菌的数量减少，安石榴苷以浓度依赖的方式抑制金黄色葡萄球菌的生长，在低于1/8 MIC浓度下，安石榴苷对细菌生长的影响较小。

2.2 安石榴苷对金黄色葡萄球菌溶血活性的影响

如图1所示，安石榴苷能够抑制金黄色葡萄球菌溶血素的产生。安石榴苷处理组的溶血活性与阳性对照组相比显著降低，且具有极显著差异，只有在1/4 MIC浓度下与对照组无显著性差异，该浓度下所表现出的特异性的原因尚不清楚。总之，安石榴苷对金黄色葡萄球菌的溶血活性有抑制作用，但抑制作用未呈现明显的剂量依赖性。溶血素作为一种外毒素是造成金黄色葡萄球菌感染的重要的毒力因子[21]，安石榴苷能够降低溶血素的表达，具有潜在的抗感染作用。

表2 菌落计数Table 2 Cell enumeration CFU/mL

**表示与对照组相比，具有极显著差异

2.3 安石榴苷对金黄色葡萄球菌凝固酶表达的影响

向血浆中加入金黄色葡萄球菌培养液后，每隔1 h轻轻倾斜西林瓶，观察是否有凝固现象。结果发现，1 h后，对照组已完全凝固，1 MIC的安石榴苷处理组未发生凝固，1/2 MIC，1/4 MIC处理组呈半凝固状态，而1/8 MIC和1/16 MIC处理组则完全凝固。连续观察至6 h，仍为上述结果。可见，安石榴苷能够以剂量依赖的形式抑制金黄色葡萄球菌凝固酶的表达。血浆凝固酶是一种侵袭性酶，其作用是使血浆中的纤维蛋白在菌体表面沉积和凝固以阻碍吞噬细胞的吞噬[22]。安石榴苷能够降低血浆凝固酶的表达，从而降低金黄色葡萄球菌的侵袭力。

2.4 安石榴苷对金黄色葡萄球菌总肠毒素表达的影响

*表示与对照组相比，具有显著差异；**表示与对照组相比，具有极显著差异

图2 安石榴苷对金黄色葡萄球菌肠毒素表达的影响

Figure 2 Effect of punicalagin on the expression ofS.aureusenterotoxins

2.5 安石榴苷对金黄色葡萄球菌毒力基因表达的影响

经琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物检测后，可见凝胶中均为单一条带，未发现非特异性条带(图3)，说明每对引物的特异性良好，可用于后续的RT-PCR反应。由图4可知，每个基因的溶解曲线均为单个峰，再次说明4个基因的引物的特异性较强，扩增产物单一。

自左向右依次为100 bp DNA分子量标准、sea、hla、agrA、16S rRNA

图3 待测基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

Figure 3 Agarose gel electrophoresis result of PCR products from genes to be tested

图4 qRT-PCR溶解曲线Figure 4 qRT-PCR dissociation curves

由图5可知，当安石榴苷的浓度为1/8 MIC时，所检测基因的相对表达量均有不同程度的下降，肠毒素基因sea和溶血素基因hla的相对表达水平分别是对照组的3%，5%，调节基因agrA的相对表达量为对照组的5%，且均与对照组具有极显著性差异(P<0.01)；在1/16 MIC浓度下，hla的表达量为对照组的68%，差异极显著，sea与agrA的表达量与对照组无显著性差异。安石榴苷对肠毒素表达的抑制作用在mRNA水平与蛋白水平上无很好的相关性，可能是由于mRNA水平代表的是上游转录因子的激活，而转录后的修饰、翻译等一系列过程对肠毒素的表达量也有直接影响。金黄色葡萄球菌在对数中后期合成的细胞膜表面蛋白和胞外蛋白受到由多个元件组成的复杂调控网络的控制，本研究中，通过qRT-PCR技术检测到安石榴苷对agrA的转录有抑制作用，故安石榴苷降低毒力因子的表达部分依赖于agr二元调控系统。

**表示与对照组相比，具有极显著差异

3 结论

安石榴苷以浓度依赖的方式抑制金黄色葡萄球菌的生长，且对溶血素、血浆凝固酶和肠毒素的表达发挥明显的抑制作用。安石榴苷能够显著减少α-溶血素的产生，但对溶血素的抑制作用未呈现浓度依赖性；在高于1/4 MIC 浓度下安石榴苷能够降低血浆凝固酶的表达，使血浆未发生明显凝固；通过酶联免疫反应法检测到在高于1/2 MIC浓度下，安石榴苷能显著降低总肠毒素的产生量；安石榴苷能显著抑制肠毒素基因sea、溶血素基因hla和调节基因agrA的转录。然而，安石榴苷在食品介质中的抑菌和抗毒力因子表达的效果尚不清楚，有待进一步研究。