miR-122、miR-150在隐匿性乙型肝炎鉴别诊断中的研究

马青松 张云芬

有研究表明当出现病毒变异或稀有亚型乙型肝炎（hepatitis B virus，HBV）感染时，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）检测结果为阴性；还有一部分患者血清HBsAg 检测阴性，但血清或者肝脏组织中HBV DNA 检测阳性，此部分患者被称为隐匿性感染［1］。隐匿性乙型肝炎临床一般无法检测到血清HbsAg，但病毒本身仍处于低复制活动状态，仍具有一定传染性，增加患者乙肝复发机率，加速肝脏疾病进展，并使其成为威胁输血安全、器官移植安全的巨大隐患［2］。据报道中国无偿献血人群中隐匿感染率约为0.01%～0.1%［3］，而在病因不明的慢性肝病、HBsAg 阴性肝癌患者中，隐匿性HBV 感染率分别高达28.3%和70.4%［4］。由于隐匿性乙型肝炎患者血清HBV DNA 拷贝数较低，有时无法通过HBV DNA 检测发现。鉴于此，临床迫切需要一种敏感度、特异度较高的隐匿性乙型肝炎诊断技术。众多研究表明，微小RNA（microRNA，miR）在HBV 复制以及乙型肝炎发生和进展过程中具有重要作用，如miR-122、miR-150，2 者在肝癌细胞中均呈异常表达［5-6］。本研究旨在探讨miR-122 和miR-150 在隐匿性乙型肝炎鉴别诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择本院2018年3月至2019年2月收治的45例隐匿性乙型肝炎患者（A组）、60例慢性乙型肝炎患者（B组）和50例健康人（C组）作为研究对象。3组年龄和性别构成比较，差异无统计学意义（P＞0.05），B 组血清HBsAg、HBeAg、HBV-DNA、谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平显著高于A 组和C 组，而HBsAb阳性率显著低于A组和C组（P＜0.05），见表1。

表1 3 组研究对象基线资料比较Table 1 Comparison of baseline data of 3 groups of subjects

纳入标准：①符合慢性乙型肝炎［7］、隐匿性肝炎［8］诊断标准；②年龄≥18 岁；③无肝硬化迹象或者其他系统性疾病。排除标准：①罹患其他肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒感染者；②合并严重肝、肾功能异常及免疫功能缺陷者；③有结核病、血吸虫病史；④酒精性脂肪肝、酗酒、脂肪肝等。所有患者均已签署知情同意书，并通过医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂

RNeasy Mini Kit 购自德国QIAGEN 公司。反转录试剂盒、TaqMan 反转录试剂盒、2×TaqMan 快速通用PCR 反应液购自美国Applied Biosystems公司。miR-122、miR-150 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。高速离心机和高速冷冻离心机均为德国Eppendorf 生产。AGT9601 型普通PCR 仪购自杭州安杰思生物科技有限公司。7500 型荧光定量PCR 仪购自美国Applied Biosystems 公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

抽取患者空腹静脉血约4 mL，混匀后于2 h 内通过3 000×g离心15 min，收集血清，-80℃低温冻存待检。

1.3.2 血清miR-122 和miR-150 检测

①RNA 提取：采用HiPure Liquid RNA/miRNA Kit 从250 μL 血清中提取总RNA。②cDNA合成：采用First Strand cDNA Synthesis Kit 以总RNA 为模板逆转录cDNA，反应体系：RNA-primer Mix（总RNA 1 μg、250 μmol/L oligo dT primer 1 μL、无酶水至总体积13 μL）、5×RT Reaction Buffer 5 μL、25 mmol/L dNTP 1 μL、25 U/μL RNase inhibitor 1μL、200 U/μL M-MLV RTase 1 μL、无酶水4 μL。混匀反应，低速离心机短暂离心后37℃孵育1 h，反应结束后，85℃灭活处理5 min，然后用无酶水对反应产物稀释5 倍，形成positive cDNA Mix。最后-20℃保存逆转录产物。③定量PCR 检测：采用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR试剂盒进行定量PCR 检测，反应体系：2 × SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，上下游引物各0.6 μL（10 μmol/L），cDNA 1 μL，dH2O 7.8 μL。反应条件：95℃30 s、95℃5 s、（60℃30 s、72℃10 s）×40 循环，于72℃检测荧光信号。反应结束后，立即进行熔解曲线分析，检测条件为72℃～95℃范围内0.5℃/次，10 s/次，30℃30 s。所有反应设置3 个复孔和无模板的阴性对照，计算Ct 值，并以U6 为内参计算标准化Ct 值。

1.4 统计学方法

应用SPSS 25.0 统计软件包处理数据，计量资料以（）表示，计数资料（%）表示。计量资料间两组间t检验，多组间比较釆用单因素方差分析，并用LSD 法进行两两比较，计数资料的比较釆用卡方检验。绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC），计算血清miR-122 和miR-150 水平的ROC 曲线下面 积（Area under the ROC curve，AUC），比较miR-122 和miR-150 的诊断价值。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组血清miR-122 和miR-150 水平比较

A 组和B 组血清miR-122 和miR-150 的Ct 值显著低于C 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而A组和B 组比较，均无显著差异（P＞0.05），见表2。

表2 3 组血清miR-122 和miR-150 水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum levels of miR-122 and miR-150 in 3 groups（±s）

表2 3 组血清miR-122 和miR-150 水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum levels of miR-122 and miR-150 in 3 groups（±s）

组别A 组（n=45）B 组（n=60）C 组（n=50）F 值P 值miR-122 25.36±1.03 25.66±1.14 31.52±1.63 364.805 0.000 miR-150 24.74±1.66 24.35±1.68 29.13±1.36 145.540 0.000

2.2 血清miR-122 和miR-150 水平诊断隐匿性乙型肝炎的ROC 曲线分析

以血清miR-122 和miR150 的Ct 值作为自变量，以是否为隐匿性乙型肝炎作为因变量，绘制ROC 曲线，如图1、表3。

图1 血清miR-122 和miR-150 水平诊断隐匿性乙型肝炎的ROC 曲线Figure 1 ROC curves of serum levels of miR-122 and miR-150 in diagnosis of occult hepatitis B

3 讨论

microRNA 是近年来肿瘤、传染性疾病等领域的研究热点和重点，现有研究表明microRNA 在肿瘤发生、进展、治疗等过程中发挥关键作用［9］，也有研究显示microRNA 能够通过影响HBV 的复制和患者免疫功能，影响乙肝肝硬化和肝癌的发生和发展，如miR-122、miR-150［10］。

表3 血清miR-122 和miR-150 水平诊断隐匿性乙型肝炎的ROC 曲线分析Table 3 Analysis of ROC curve of serum levels of miR-122 and miR-150 in diagnosis of occult hepatitis B

miR-122 具有肝脏特异性，在肝脏发育、细胞分化、脂质代谢、应激反应和肝细胞癌的发生进展等过程的信号通路中具有重要的作用。有研究采用基因敲除技术沉默miR-122 表达，发现乙肝病毒转染的Huh7 细胞HBsAg 和HBeAg 表达显著降低［11］。Gao 等［12］研究则表明miR-122 表达下调可造成干扰素表达降低，进而诱导HBV 感染。miR-122 表达上调能够降低血红素氧化酶1 表达水平［13］，而血红素氧化酶1 具有抗HBV 作用，提示miR-122 表达上调能够抑制HBV 复制。本研究结果表明，A 组和B 组患者血清miR-122 的Ct 值显著低于C 组（P＜0.05）。

研究发现T 细胞、B 细胞、巨噬细胞等免疫细胞中miR-150 可在感染、肿瘤和自身免疫性疾病等病理状态下呈高表达状态［12］。但目前对miR-150的研究较少，据现有研究结果可知，miR-150 能够抑制c-myb 基因表达进而抑制细胞增殖，但miR-150 在不同肿瘤组织中表达水平有所差异，在子宫内膜癌中高表达，在胃癌中则呈低表达［14］。陈渊源研究显示慢性乙型肝炎患者和隐匿性乙型肝炎患者的血清miR-150 水平与健康者显著高于健康者［15］。本研究结果也表明A 组和B 组患者血清miR-150 的Ct 值显著低于健康者，提示肝炎患者血清miR-150 水平上调。

本研究采用ROC 曲线探讨了血清miR-122 和miR-150 水平鉴别诊断隐匿性乙型肝炎的效能，结果表明，血清miR-122 和miR-150 鉴别诊断隐匿性乙型肝炎的最佳截断Ct 值分别为28 和26，敏感度、特异度分别为95.56%、88.00%和91.58%、91.11%，2 个指标均具有良好的诊断效能。

综上，血清miR-122 和miR-150 鉴别诊断隐匿性乙型肝炎具有良好的敏感性和特异性，可进一步探讨两种miRNA 在HBV 感染、复制和乙型肝炎进展中的作用机制，以确定miR-122 和miR-150 应用的效能和安全性。