高灵敏度HBV DNA临床检测应用现状及发展趋势

里进 李一荣

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一个严重的全球性公共健康问题，全球约20 亿人感染过HBV，其中2.57 亿人为慢性HBV 感染者［1］，每年约有65 万人死于HBV 感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌（hepatic cell carcinoma，HCC）［2］。目前，HBV 感染的病毒学诊断和监测主要依据免疫学检测和核酸检测，而核酸检测由于可以准确定量，并能实时监测病毒感染状态和抗病毒疗效，因此在乙肝临床诊断和决策中有着突出的临床价值［3］。近年来，高灵敏度HBV DNA 技术因其检测下限低和线性范围广等优点，越来越受到临床医生的关注，许多专家和指南也将高灵敏度HBV DNA 检测结果作为乙肝病毒核苷酸类药物治疗终点的重要指标。虽然高灵敏度HBV DNA 检测目前在临床应用过程中还存在诸多问题，但由于其技术自身的优势，未来将成为HBV-DNA 检测发展的必然方向。

1 高灵敏度HBV DNA 临床检测应用现状

1.1 国内外行业指南

除了指导临床合理停药，高灵敏度HBV DNA检测还在术前/输血前筛查［4］、化疗/免疫抑制剂治疗监测［5］、器官移植病毒残留检测［6］以及隐匿性HBV 感 染（occult hepatitis B virus infection，OBI）检测［7］等方面起到了关键性作用，相关行业指南也针对高灵敏度HBV DNA 检测做了说明（参见表1）：①亚太肝病学会（Asian Pacific Association for the Study of Liver，APASL）在2015 版的乙型肝炎防治指南中指出对于持续性病毒学应答（sustained virologic response，SVR）患 者，当HBV DNA≥100 IU/mL 时判断为HBV 复发。对于HBV DNA 低于检测下限的含义，APASL 明确指出高灵敏度HBV DNA 检测应为＜12 IU/mL［8］；②美国肝病学会（American Association for the Study of Liver Disease，AASLD）在2018 版的慢性乙型肝炎防治指南中指出慢乙肝病人乙肝表面抗原阴转后，通常表现较低的HBV DNA 水平（20～200 IU/mL），如果这类人群始终没能产生乙肝表面抗体，其肝癌发生率和非活动性慢乙肝病人类似［9］。AASLD还给出了几种主要核苷酸类药物治疗的cut-off值：恩替卡韦和替诺福韦＜60 IU/mL 时判断抑制乙肝病毒有效；替诺福韦艾拉酚胺（二代替诺福韦）＜29 IU/mL 时判断抑制乙肝病毒有效；③欧洲肝病学会（European Association for the Study of the Liver，EASL）2017 版的乙型肝炎感染防治指南写到对于高灵敏度HBV DNA 检测，核苷酸类药物病毒学应答定义为＜10 IU/mL。EASL 同时指出对于乙肝肝硬化失代偿人群，HBV DNA＞20 IU/mL 患者比HBV DNA＜20 IU/mL 患者更易发展为肝癌［10］；④世界卫生组织（World Health Organization，WHO）2015 版的慢性乙型肝炎感染防治指南规定高灵敏度HBV DNA＜15 IU/mL 时为未检出HBV 病毒［11］；⑤我国中华医学会肝病学分会2015年出版的慢性乙型肝炎防治指南中并未明确指出高灵敏度HBV DNA 检测的下限，但对于乙型肝炎再活动的定义也是≥100 IU/mL，此外，对于非活动性HBV 携带者必须满足HBV DNA 低于检测值下限或＜200 IU/mL［2］。

表1 各指南关于高灵敏度检测HBV-DNA 临床应用说明Table 1 Guidelines for Clinical Application of the ultrasensitive HBV-DNA detection

1.2 高灵敏度HBV DNA 试剂

从以上各指南可以看出，国内外专家均高度肯定了高灵敏度HBV DNA 检测在HBV DNA 定量中的意义，这一方面是因为极低水平的HBV DNA 在部分人群中确实有着重要的临床意义，另一方面也是因为传统HBV 检测已不能满足目前临床的需求。正因如此，已有不少针对高灵敏度HBV DNA 检测的方法学研究报道［12-14］，成品的试剂盒也逐渐得到中国食品药品监督局（China food and drug administration，CFDA）批准进入我国市场。表2列举出几家主要的高灵敏度HBV DNA试剂厂家（均经CFDA 批准），进口试剂有3 家，国产试剂有5 家。由于磁珠法核酸提取效率最高，这8 家高灵敏度试剂厂家均采取了磁珠法提取HBV 核酸。此外，这8 家试剂厂家HBV 检测灵敏度也都能达到10～15 IU/mL，不少试剂可以达到10 IU/mL，但是在一些关键参数上各有不同，主要体现在以下几点：①血清/血浆提取量：国外试剂基本取0.5 mL 血清/血浆做核酸提取，国内只有复星一家试剂提取量＞0.5 mL，血清/血浆提取体积越大纳入的HBV DNA 载量也越大，假阴性率越低；②上样量：上样量指的是加入到PCR 体系中的HBV 核酸洗脱液体积，目前只有罗氏和圣湘两家试剂可将提取好的全部核酸连同磁珠一起上PCR仪扩增，其他产品只能将提取的部分核酸（20～40 μL）进行PCR，因此存在丢失核酸的风险，核酸丢失会使PCR 结果产生偏差而偏离真实值；③HBV基因型覆盖度：有少数几家基因型覆盖不全，对特殊基因型有漏诊的风险；④内标：除罗氏是定量内标外，其他厂商试剂内标都属于竞争性内标/非竞争性内标，不参与定量，也不能监控各管的扩增效率，如果样本中存在黄疸、溶血等干扰因素，将对结果产生一定的影响；⑤成本差异：罗氏公司COBAS HBV DNA 高灵敏度试剂因其性能优异，是国内外同行公认的参比试剂，但其成本过于昂贵，患者难以承受，临床使用较少。相比之下国内试剂及耗材成本低廉，仪器通用性好，在许多医院也得到了应用。因此，虽然这些试剂都称作高灵敏度HBV DNA 检测，但在检验效能上还是存在一定的差异。

表2 部分高灵敏度HBV-DNA 试剂生产厂家对比Table 2 Comparison of these different ultrasensitive HBV-DNA detection reagents

2 高灵敏度HBV DNA 临床检测应用过程中的问题及对策

2.1 核酸污染

高灵敏度核酸检测对临床基因扩增（PCR）实验室来说犹如“达摩克利斯之剑”，虽然拥有极高的检出能力，但也有着无法回避的问题，这个问题就是检测结果容易受核酸污染的影响［15-16］。核酸污染会导致假阳性结果，一旦发生后，围绕整个PCR 实验室寻找污染源是一件十分耗时、耗力的事情。轻度核酸污染要终止实验，待污染清除之后再开始，重度核酸污染可能需要更换设备、仪器甚至场地。PCR 实验室最常见的污染源是气溶胶（aerosol），产生气溶胶最主要的操作环节是提取和扩增步骤［17］。有研究报道一个109copies 扩增产物其产生的最小气溶胶中靶序列核酸含量也有106copies［18］。如果气溶胶污染不加控制，在相对较短的时间内，气溶胶中的核酸产物就可能污染移液器、试剂、设备、桌面地面、生物安全柜以及整个通风系统［19］。因此，各开展高灵敏度HBV DNA 检测的单位应对核酸污染防控应给予高度重视，相应的标准操作规程（standard operating procedures，SOP）要严于普通HBV DNA 检测流程。

以下结合我单位的工作经验，列举几点主要注意事项：①高灵敏度核酸检测建议在全自动封闭式核酸提取系统中进行，样本提取纯化后自动转移至扩增检测系统，整个过程未经任何开盖操作，可最大限度的防止气溶胶的产生；②全自动核酸提取系统建议单独一间房间使用，不应与普通HBV DNA 检测共用一间房间，因为普通核酸提取多采用煮沸法，极易产生气溶胶，造成交叉污染；③选用含有UNG 酶/dUTP 防污染体系的试剂，这类试剂盒以dUTP 取代dTTP，所以PCR 产物都含有dU 碱基。PCR 开始前增加50℃2 min 步骤，UNG 酶即可特异性地将反应体系中残留U-DNA污染物序列降解，并在95℃时被灭活，不会再降解新扩增的产物U-DNA，从而保证扩增结果的特异性和准确性。④实验前、实验后常规消毒、紫外线照射，每天实验前用75%酒精擦拭需要使用的移液器和设备，实验后用喷壶对全房空气喷洒75%酒精，用含氯量500 mg/L 的84 消毒液拖地，用75%酒精擦拭使用过的移液器、桌面和设备，可有效消除和防控气溶胶的污染；⑤定期监控，可将多个装有纯净水的Ep 管打开静置于提取及扩增检测区30～60 min，同时用沾水的棉签擦拭使用过的移液器、桌面和设备，将这些监控物同样本一样提取上机扩增，若为阳性则说明实验室有核酸污染的存在。⑥其他方面，如实验室分区设计、人员物品流向、空气流向、扩增产物处理等按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》执行［20］。

2.2 行业监管及标准

目前，高灵敏度HBV DNA 检测国内外暂没有统一的行业标准，国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）针 对 临 床PCR 实验室最新一版管理文件CNAS-CL02-A009：2018 也没有相关说明和要求［21-22］。室内质控、试剂盒性能验证、精密度与正确度的判定、抗干扰能力等相关质量管理程序都处在空缺的状态。此外，临床基因扩增实验室评审和省部级临检中心也没有涉及高灵敏度HBV DNA 检测的项目，这都为高灵敏度HBV DNA 检测标准化管理带来了不少难度。尽管行业监管及标准缺如，但开展高灵敏度HBV DNA 检测的单位却越来越多，从第三方检测机构、医院检验科到各小型实验室都有，报告单上虽然都标注的是高灵敏度HBV DNA 检测，但背后的质量却参差不齐。因此，尽快形成一个高灵敏度HBV DNA 检测的行业标准是一件迫在眉睫的事情。

3 高灵敏度HBV DNA 检测发展趋势

从表1可以看出，部分指南将高灵敏度HBV DNA 检测下限定在10～15 IU/mL，虽然本文列举的产品灵敏度能达到10 IU/mL，但这些试剂检测下线多在20 IU/mL，这意味着10～20 IU/mL 的样本多数情况下是测不准的，因此，目前的试剂检测性能离各专业学会的指南要求还有一定的差距，需继续发展新的检测技术（如数字PCR，digital PCR）去探寻更低的检测下限。例如，Liu Y 等人将罗氏COBAS TaqMan 方法与数字PCR 方法同时检测替诺福韦治疗后的人群发现，罗氏COBAS是无法区分＜58 copies/mL 的患者，而数字PCR 检测能力可以低至8 copies/mL［23］（1 IU/mL≈5.3 copies/m［11］）。Hui Tang 等人利用pAAV/HBV 1.2 质粒发现数字PCR 方法的检测上线是105copies，而下限甚至达到1 copy［24］。最近，鲁凤民等人建立了一种跨缺口数字PCR 技术，不但可以高灵敏度的检测HBV DNA 载量，还可以特异性检测隐匿性乙肝人群（OBI）中有HBV 复制能力的病毒核酸片段（松弛环状双链DNA，rcDNA 和共价闭合环状DNA，cccDNA），从而更加精准的评估OBI 人群的预后［7］。

随着新技术的出现，HBV DNA 检出能力会越来越高，但这并不意味着每个乙肝患者都需要高灵敏度HBV DNA 检测。国内外指南虽然对慢性乙型肝炎抗病毒治疗的诊断标准不同，但对于HBV DNA 的治疗水平都基本一致，例如对于HBeAg 阳性（大三阳）患者，中国、亚太和美国指南建议HBV DNA≥20 000 IU/mL，HBeAg 阴性（小三阳）患者HBV DNA≥2 000 IU/mL 需接受抗病毒治疗；欧洲和英国指南较为谨慎，不考虑HBeAg 状态，其HBV DNA＞2 000 IU/mL 则需要接受抗病毒治疗［25-26］（各指南建议的慢性乙型肝炎抗病毒治疗指征参见表3）。由此可见，对于大多数慢性乙肝患者抗病毒治疗的初期是不需要使用高灵敏度HBV DNA 检测，仅在评估停药时间点上需要使用到高灵敏度HBV DNA。因此，临床医生可根据患者的病情，选择合适的方法去检测，如当HBV DNA＞2 000 IU/mL 时，性价比高的普通HBV DNA 检测仍然是可靠的；当HBV DNA＜500 IU/mL（传统HBV DNA 检测下限）时，亦或是特殊乙肝人群（输血、移植、隐匿性感染等），敏感度更高的高敏HBV DNA 检测技术才能体现其价值。

表3 各指南关于慢性乙型肝炎抗病毒治疗的指征Table 3 The recommendations for antiviral treatment of chronic hepatitis B in the guidelines

4 总结

在“精准医学，精准治疗”的时代背景下，高灵敏度HBV DNA 检测是大势所趋。在保证检测质量的前提下，高灵敏度HBV DNA 检测项目如能进一步降低成本并纳入医保，将必然取代传统乙肝病毒核酸检测方法。虽然目前这一领域还存在不少问题和瓶颈，但随着技术的进步和学术机构的推广，相信以高灵敏度HBV DNA 检测为代表的感染性病原体精准检测将逐步规范并广泛应用于临床，最终造福每一位患者。