双靶标高敏HBV DNA检测技术在HBeAg阴性患者临床诊断中应用

冯磊

乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是乙型肝炎病毒的简称，为临床上引起乙型肝炎的病原体，其感染已呈世界性流行并成为全球性的公共卫生问题［1-2］。由病毒引起的乙型肝炎具有发病慢、传染性强、传播途径多样等特点，多数乙肝病毒携带者在临床表现上呈现不出明显症状，因此临床诊断上具有一定的困难［3-4］。目前，临床诊断HBV 感染主要通过血清特异性抗原抗体免疫检测和HBV DNA 检测来实现。随着新型抗病毒药物不断问世，抗病毒药物得到广泛应用，加之乙型肝炎疫苗免疫普及，感染HBV 人口老龄化等，急性HBV 感染明显减少，HBeAg 阴性慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的比例有所上升［5-7］。研究表明，HBeAg 阴性CHB 是一种特殊的CHB 临床类型，主要诱因为HBV 变异和（或）宿主免疫压力，与HBeAg 阳性CHB 比较，具有隐匿性强，临床症状极不明显的特点［2，6］。通常，HBeAg 阴性CHB 患者年龄更大，病史更长，肝脏纤维化程度更为严重，而且在抗病毒的治疗中应答率对比其他类型患者更低，所以治疗效果多不理想，更易进展为肝硬化和原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［8-10］。故而找到一种更加有效的检测方法，对于判断病毒复制水平、评估疾病发展状态、选择有效治疗方案具有重大意义。本文比较双靶标高敏乙肝检测技术与传统普敏乙肝检测技术对HBeAg 阴性HBV 感染者检出率之差异，探讨双靶标高敏乙肝DNA 检测在诊治中的优势。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年3月至2019年7月在本院就诊的180 例血清HBeAg 阴性HBV 感染患者为研究对象。所有患者，包括乙型肝炎肝硬化代偿期、慢性乙型病毒性肝炎患者均满足《2015年慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准；研究对象筛选过程中排除血液标本中出现溶血、脂血者，其中男性110 例，女性70 例，年龄21～90 岁，平均年龄（47.92±13.42）岁。所有患者及家属均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取与PCR 反应体系构建

核酸提取或纯化试剂（DA622）（购自中山大学达安基因股份有限公司）的预封装96 孔板中加入4 μL 内标液、20 μL 蛋白酶K、200 μL 血清样本和阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品及4个阳性定量标准品，将其放入Smart32 半自动核酸提取仪（购自中山大学达安基因股份有限公司），按核酸提取试剂盒说明书设置提取程序，运行结束后，将所得核酸（40 μL/孔）加入PCR 反应管中（含配置好的反应液20 μL）。PCR 扩增仪为ABI Prism 7300 仪器，均购于中山大学达安基因股份有限公司。

1.2.2 高敏核酸检测方法

采用中山大学达安基因股份有限公司生产的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR 荧光探针法）（DA-Z051，双靶标），扩增程序设置为：50℃2 min，1 个循环；95℃15 min，1 个循环；94℃15 s，55℃45 s，45 个循环。双靶标高敏试剂最低定量检测限20 IU/mL，检测灵敏度10 IU/mL。

1.2.3 普敏法核酸提取

核酸提取试剂采用中山大学达安基因股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR荧光探针法）（DA0030），扩增程序设置为：93℃2 min，1 个循环；93℃45 s，55℃60 s，10 个循环；93℃30 s，55℃45 s，30 个循环。普敏法最低定量检测限100 IU/mL，检测灵敏度30 IU/mL。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。符合正态分布计量资料用（）表示，采用t检验；非正态计量资料比较，采用非参数检验；计数资料以n或（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2 种试剂的检测结果

双靶标高敏乙肝检测法与普敏检测法180 例患者血清HBV DNA 载量情况，见表1。

2.2 2 种不同方法检测HBV DNA 阳性率比较

双靶标高敏乙肝检测法的阳性率显著高于普敏法，差异具有统计学意义（P＜0.001），见表2。

2.3 2 种不同方法检测HBV DNA 水平比较

76 例HBeAg 阴性患者中两种不同的方法对不同年龄、性别的患者HBV-DNA 水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；临床诊断慢性乙型肝炎患者HBV-DNA 水平显著高于临床诊断非活动性HBsAg 携带者，差异具有统计学意义（P＜0.01，见表3）。

表1 2 种试剂测定HBV DNA 结果（IU/mL）Table 1 Determination of HBV DNA results by 2 reagents（IU/mL）

表2 2 种试剂检测HBV DNA 阳性率比较［n（%）］Table 2 Comparison of HBV DNA positive ratesdetected by 2 reagents［n（%）］

3 讨论

随着生活水平的不断提升，乙肝的发病率也有所上升，且因其隐匿性强，一般未见有明显的临床表现，多为体检发现，当出现临床症状时常已经发展为严重的肝脏疾病，如肝硬化、肝癌等，故而能在疾病发展早期就可敏锐发现其发病趋势将有效控制乙肝发病率。HBV DNA 定量检测已经广泛应用于临床，主要为慢性HBV 感染患者判断其体内病毒的复制水平即活跃程度，也是最直接、最可靠的指标，并同时为医生诊疗和预后判断提供重要的参考依据［11］。

表3 2 种试剂检测HBV DNA 水平比较［n（%）］Table 3 Comparison of HBV DNA levels detected by 2 reagents［n（%）］

运用荧光定量PCR 技术检测HBV DNA 具有精密度好、灵敏度高、特异性强等特点［12］。在目前国内临床上使用的HBV DNA 荧光定量PCR 试剂种类很多，各类试剂之间的性能参数如灵敏度、特异性、线性范围等方面均存有差异［17-18］。

高敏HBV DNA 检测分析采用更智能的方式对血液标本实施核酸提取、纯化，其回收率较高，且重复性也较好，人为误差也有所降低使检测结果更加准确；且高敏法使用内部标准品，所以在检测样本的同时提取、扩增，可消除管间差异使检测结果更为可靠。普敏乙肝检测方法在临床中的应用范围广，但回收率偏低、重复性差，并且费时费力，容易造成人为误差，导致普敏法对于病毒定量检测的准确性偏低，特别在低载量病毒核酸分析中定量分析的效果更差［13-15］。C 区突变或S 区突变可能导致e 抗原或表面抗原表达过低或不表达，造成免疫学相关检测阴性，但核酸可以检测到。双靶标高敏试剂是针对C 区和S 区设计双引探，对病毒变异珠的检出能力增强，核酸提取、纯化、回收率较高，核酸纯度高，且重复性也较好，相对而言，对低病毒载量样本检测结果更加准确［14，16-18］。

本研究显示，180 例血清HBeAg 阴性患者中，双靶标高敏法检测出阳性103 例，阴性77 例，阳性检出率52.2%；普敏法可检测出35 例阳性，145 例阴性，阳性检出率19.4%。两种研究方法的对比中，双靶标高敏法的检出率显著高于后者，差异具有统计学意义（P＜0.001），这与双靶标高敏试剂可同时检测两区变化有直接联系。双靶标高敏法在临床诊断慢性乙型肝炎患者HBV DNA 水平显著高于临床诊断非活动性HBsAg 携带者，差异具有统计学意义（P＜0.01），即双靶标高敏检测法可更为准确的检测出HBeAg 阴性乙肝肝硬化患者的低载量病毒进而准确指导医生用药，尽早精确控制病情，延缓肝脏疾病的不良事件的发生发展。该研究的结果与以往的研究［19-20］结果一致，具有一定的科学依据。

综上所述，双靶标高敏检测法用于血清HBV DNA 定量检测准确性更高，较普敏法而言，超敏定量分析法对病毒检测精确度更佳，及时有效，漏检率更低，保证检测结果的正确性，判断患者是否感染有病毒，可作为筛查，治疗起点，疗效评估，治疗终点的评判依据，其临床应用价值较高。由于本文病例的选择并非完全随机，因此，未来还需要通过大样本、多中心的数据来验证确切的结论。