高灵敏度HCV RNA检测在慢性丙型肝炎患者中的诊断及治疗检测应用

黄成军 程书权

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）RNA 载量测定是判断丙型肝炎现行感染和治疗效果的基本手段，目前应用的有普通检测方法（检测下限＜1 000 IU/mL）和高灵敏度检测方法（检测值下限为15～20 IU/mL），既往由于后者的检测试剂只有罗氏、雅培等国外公司提供，价格昂贵，故我国大多数地区由于经济条件的限制，HCV RNA 临床实验室以普通检测方法占主导，以手动操作为主，易污染出现假阳性［1］，检测结果线性范围窄，灵敏度低，不能用于准确判断病毒学应答情况［2|，近年，随着达安等国内厂家的高灵敏度HCV RNA 试剂及检测方法的面世，大大降低了成本，使其普及成为可能。本研究同时使用2 种HCV RNA 检测方法应用于慢性丙型肝炎患者的诊断及治疗后对比，以探讨2 种检测方法在慢性丙型肝炎的筛查、诊断和疗效判断的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2017年12月至2019年3月到本院初次就诊的130 例丙肝抗体阳性的患者为初治组，所有患者均未接受过抗病毒治疗。同时收集既往曾经抗病毒治疗，疗程结束后用普通方法检测结果为阴性且达到12 周持续病毒学应答（sustained virological response，SVR）的148 例患者为停药组。另选取2018年6月至2019年3月就诊的慢性丙型肝炎初治患者46 例，予抗病毒治疗，治疗前均行HCV 基因分型检查确定为1b 型。停药组及行抗病毒治疗的患者均符合《丙型肝炎防治指南》的慢性丙型肝炎诊断标准［3］，排除标准：①曾接受过抗HCV 治疗的患者；②合并其他嗜肝病毒感染，如乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒等；③合并其他类型的肝病，如自身免疫性肝病等；④发生肝硬化或者原发性肝癌；⑤合并其他免疫系统疾病或孕期妇女：⑥依从性差不能配合治疗和随访者。本研究均获得患者知情同意签字并获得本院伦理委员会批准。

1.2 治疗方法

46 例1b 型慢性丙型肝炎患者给予达诺瑞韦钠片（商品名：戈诺卫，歌礼药业（浙江）有限公司，用法：100 mg/次，2 次/d），聚乙二醇干扰素a-2a 注射液（商品名：派罗欣，上海罗氏制药有限公司，用法：180 ug/次，1 次/d），利托那韦（商品名：艾治威，AbbVie Deutschland GmbH ，德国，用法：100 mg/次，2 次/d），利巴韦林（上海信谊天平药业有限公司，用法：500 mg/次，2 次/d）。均予患者强调抗病毒治疗的依从性，嘱家属监督按时、按量服药，疗程12 周。

1.3 检测仪器与试剂

普通检测方法采用DA-7600 荧光定量PCR 仪，检测试剂为丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），仪器设备及试剂均购自中山大学达安基因股份有限公司。

高灵敏度检测方法采用SLAN-96P 全自动荧光检测系统，检测试剂为高灵敏丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），核酸提取或纯化试剂配套Smart32 核酸提取仪使用，除扩增仪器购自上海宏石医疗科技有限公司，其余仪器设备及试剂均由中山大学达安基因股份有限公司提供。

1.4 检测方法

普通HCV RNA 检测方法：按照丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒提供的核酸提取试剂对血清进行处理和核酸提取，然后进一步行PCR 扩增。循环条件如下：50℃15 min，1 个循环；95℃5 min，1 个循环；94℃15 s 至55℃45 s，45 个循环。高灵敏HCV RNA 检测方法：按照高灵敏丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒提供的试剂对血清进行处理，根据核酸提取或纯化试剂和Smart32 核酸提取仪的说明书进行核酸提取，然后进一步行PCR 扩增。循环条件如下：50℃15 min，1 个循环；95℃15 min，1 个循环；94℃15 s 至55℃45 s，45 个循环。

1.5 观察指标

记录2 种检测方法检测初治组和停药组的阳性率，记录46 例1b 型慢性丙型肝炎患者治疗前及治疗2 周、4 周、12 周后2 种检测方法检测为阳性的例数，并进行对比分析。

1.6 统计学方法

本研究数据均用SPSS 20.0 统计软件处理，计数资料用例数（n）表示，计数资料组间率（%）的比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 种检测方法在初治组和停药组的比较

初治组采用普通检测方法阳性率96.2%，高灵敏度检测方法阳性率96.9%，两者对比差异无统计学意义（P＞0.05）。停药组普通检测方法阳性率4.1%，高灵敏度检测方法阳性率10.8%，后者阳性率高于前者（P＜0.05），见表1。

表1 2 种方法在初治组和停药组的检测结果比较［n（%）］Table 1 Comparison of 2 methods in the intial treatment group and the drug withdrawal group［n（%）］

2.2 2 种检测方法在抗病毒治疗过程中的比较

46 例1b 型慢性丙型肝炎患者治疗前2 组检测均为阳性，高灵敏度检测方法组在治疗后2 周检测HCV RNA 阳性率均明显高于普通检测方法组（P＜0.05），两种检测方法治疗前、治疗4 周后及治疗12周后对比无统计学差异（P＞0.05），见表2。

表2 2 种方法在46 例患者抗病毒过程中的检测阳性率结果比较［n（%）］Table 2 Comparing the positive percentages in the process of antiviral treatment with 2 methods［n（%）］

3 讨论

近年，随着我国卫生健康事业的发展，许多传染病如麻风病、麻疹、鼠疫等已经基本消灭或得到良好控制，在病毒性肝炎方面，由于母婴阻断治疗的广泛应用和疫苗计划免疫的实施，我国新生人口的乙肝发病率已大大下降，而丙型肝炎作为一个“沉默的杀手”，已渐渐浮出水面。目前全世界约有1.85 亿人感染HCV，其中60%～85% 的HCV 感染者发展为慢性丙型肝炎［4］，而我国约1 000 万HCV 感染患者，在高流行区域，由于注射毒品及性传播，丙肝患病率甚至可超过60%［5］。慢性丙型肝炎患者多无不适症状，且半数以上者无明显肝功能异常，就诊原因常为出现HCV 感染的肝外症状（如类风湿性关节炎、干燥综合症或肾小球肾炎等）或者发展到肝硬化、肝癌后出现一系列症状和并发症而就诊。慢性丙型肝炎患者病情虽进展缓慢，最终可能发展至肝硬化或肝细胞肝癌［6-7］，由于HCV 感染目前仍无有效疫苗预防，所以及早明确诊断并予治疗是防治慢性丙型肝炎的关键。HCV RNA 是确认丙型肝炎现症感染的检验手段，患者只要被检测出HCV RNA 阳性就应进行抗病毒治疗，这已成为国内外的一致共识，故HCV RNA 检测已成为慢性丙型肝炎的诊断和治疗前评估的重要依据。本研究采用普通检测方法和高灵敏度检测方法对我院就诊的130 例未经治疗的慢性丙型肝炎患者进行HCV RNA 检测，结果提示，对于慢性丙型肝炎的诊断，使用普通检测方法和高灵敏度检测方法进行HCV RNA 的检测效果相当，但对于经治患者，在判断是否出现停药后复发时，使用高灵敏度检测方法明显优于普通方法。

慢性丙型肝炎治疗的目标是控制肝脏炎症及纤维化，预防或减少HCV 感染导致的并发症，改善患者生活质量、切断HCV 的持续传播，而这一切需要通过抗病毒治疗来实现。抗病毒治疗的成功标准是早期达到快速病毒学应答（rapid virological response，RVR）及尔后保持SVR。SVR 是治疗后出现RVR 的有效延续，故治疗时的HCV RNA的转阴率及其出现时间成为了关键。欧洲肝病研究学会（EASL）早把高灵敏的HCV RNA 检测方法作为监测抗病毒治疗效果的首选［8］，普通检测方法因其灵敏度较低往往不能准确的判断病毒学应答情况［2］。本研究采用普通方法和高灵敏方法检测抗病毒治疗过程中的HCV RNA 的变化时发现：在抗病毒治疗2 周后，HCV RAN 虽快速下降，但大部分患者血清中仍存在少量HCV RNA，由于普通检测方法灵敏度不高，其HCV RNA 阳性率明显低于高灵敏度检测方法组。所以，使用高灵敏度的HCV RNA 检测方法有助于更准确鉴定真实的RVR，排除假阴性，从而为确定抗病毒治疗疗程提供更可靠的依据［9］，治疗4 周后及治疗12 周后2 种检测方法对比虽无统计学差异，值得注意的是，自DAAs 上市以来，丙型肝炎的抗病毒治疗有效率虽明显提高［10-11］，但至今仍无有效率达100%的治疗方案，正如本研究中所发现的一样，治疗12 周后仍有1 例患者使用高灵敏度方法能检测出HCV RNA，如该患者抗病毒治疗过程中使用普通方法检测HCV RNA 变化，可能出现假阴性，未能及时调整方案，从而导致治疗失败，如使用高灵敏度方法在治疗过程中监测HCV RNA，可真实反映治疗效果，临床医生可根据HCV RNA 变化及时调整治疗方案，才可使治愈率进一步提升从而尽可能接近100%。

HCV RNA 的2 种检测方法外在表现为检测指下限不同，可能与2 者检测操作过程中核酸提取方式不同有关。普通方法使用丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒自带的一步法提取，高灵敏度方法使用核酸提取或纯化试剂在Smart32 核酸提取仪上进行核酸提取，后者更先进的核酸提取方式使核酸提取纯度和精确度大大提升，从而使其检测结果更灵敏和准确。采用高灵敏度HCV RNA 检测方法可及时判断慢性丙型肝炎治疗后有无复发，必要时进行再治疗，进一步控制疾病进展，降低肝硬化及肝癌的发生率；同时，使用高灵敏度HCV RNA 检测方法监测抗病毒治疗过程中的病毒量变化，可发及时现治疗效果不佳的患者，尽早调整治疗方案，从而提高治疗有效率，避免和减少治疗失败后二次治疗的高额费用，减轻患者的经济负担。故我们认为高灵敏度HCV RNA 检测方法是慢性丙型肝炎抗病毒治疗及停药后复查监测的首选。

综上所述，与普通HCV RNA 检测方法相比，高灵敏度检测法用于监测和评价慢性丙型肝炎患者的疗效灵敏性更高，可用于指导慢性丙型肝炎的疗效评估。