血清miR-483-5p、miR-21和miR-25检测在非小细胞肺癌诊断中的价值

李世荣，刘艳，王振明，宋明泽，焦红娟

(1潍坊市人民医院，山东潍坊261041；2潍坊医学院临床检验诊断学系；3巨野县人民医院)

肺癌是世界上发病率较高的恶性肿瘤之一，且近年来有不断上升的趋势[1,2]。许多患者就诊时已经处于晚期阶段，丧失了早期治疗的机会。由于非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的大多数，因此，寻找高敏感度和特异度的NSCLC标志物具有重要的临床意义。MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为20～25个碱基的具有调节功能的非编码RNA，不仅能通过互补碱基配对方式识别靶mRNA，降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译[3]，还可以与细胞中的原癌基因和肿瘤抑制因子相互作用[4,5]，从而参与癌基因的表达。研究表明，肺癌患者血清miRNAs表达谱变化与肺癌病情变化具有直接的关系，其在肺癌早期诊断中具有重要价值[6]。本研究分析血清hsa-miRNA-483-5p(miR-483-5p)、hsa-miRNA-21(miR-21)和has-miRNA-25(miR-25)在NSCLC患者血清中的表达及其诊断价值，并与常用的NSCLC肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和非小细胞肺癌相关抗原21-1(CYFRA21-1)进行比较。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年9月～2016年5月潍坊市人民医院呼吸科收治的NSCLC患者32例作为NSCLC组，男21例、女11例，年龄(60±9)岁，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期22例。淋巴结转移20例。组织学类型包括腺癌13例、鳞癌14例、其他5例。所有患者均经纤维支气管镜活检或穿刺活检或外科手术标本取样，经病理组织学检查确诊，排除肺癌以外的其他系统肿瘤。选择非肿瘤性良性肺病(NCPD)包括肺炎、肺结核、肺纤维化等患者22例作为NCPD组，男13例、女9例，年龄(61±9)岁。另选择健康查体者20例作为Control组，男11例、女9例，年龄(59±7)岁。各组年龄、性别比例差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 标本采集 抽取静脉血5 mL于含分离胶的试管中，室温下静置1 h。室温4 100 r/min，离心10 min，收集血清于分离管中。

1.3 血清CEA、NSE和CYFRA21-1水平检测 用Roche公司的Cobas e601电化学发光免疫分析仪及其配套试剂盒，测定血清CEA、NSE和CYFRA21-1水平，按照说明书操作。

1.4 血清miR-483-5p、miR-21、miR-25表达检测

1.4.1 RNA提取 采用传统的苯酚-氯仿提取方法，并在加入苯酚后加入2 μL 25 fmol/L人工合成的线虫cel-mir-39作为外源性内参。提取好的RNA放在-80 ℃储存。

1.4.2 PCR反应 cDNA合成试剂盒购自美国ABI公司，针对每一种miRNA设计一条含有茎环结构的基因特异性反向引物，利用miRNA特异性反向引物进行逆转录，得到含共同茎环结构但属于特定microRNA的cDNA。每个逆转录反应的总体积为15 μL，其中包括7 μL RT混合物(0.15 μL dNTP、1.00 μL 酶、1.50 μL RT缓冲液、0.19 μL RNA酶抑制剂、4.16 μL无酶的DEPC水)、5 μL总RNA和3 μL RT引物。PCR条件参数为：16 ℃、15 min，42 ℃、1 h，85 ℃、5 min，得到cDNA。反应结束后立即将cDNA产物取出，快速置冰上冷却，产物置于-20 ℃冰箱保存以备用。

1.4.3 实时荧光定量PCR 采用荧光探针方法检测样本中RNA的含量。反应体系包括1.33 μL RT产物，1.00 μL 20×TaqMan miRNA Assay(ABI)，10.00 μL 2×TaqMan通用PCR混合物(ABI)和7.67 μL无酶的DEPC水。扩增参数为：95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40个循环。每个样品加3个复孔。miRNAs的相对表达量用2-ΔΔCt的方式来计算，ΔΔCt=(实验组Ct-cel-mir-39 Ct)-(Control组Ct-cel-mir-39 Ct)。

1.5 统计学方法 应用GraphPad Prism 5.01和SPSS17.0统计软件。三组间比较采用非参数Kruskal-WallisH检验，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。血清CEA、NSE及CYFRA21-1数据呈偏态分布，用中位数(四分位数)[M(P25～P75)]表示。用受试者工作特征曲线(ROC)确定miRNAs和CEA、NSE及CYFRA21-1诊断NSCLC的曲线下面积(AUC)、敏感度和特异度。敏感度和特异度比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平比较 NSCLC组血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平均高于Control组(U分别为191.00、100.50、143.00，P分别为0.015、0.000、0.001)。见表1。

2.2 血清CEA、NSE、CYFRA21-1单项及联合检测诊断NSCLC的ROC分析 CEA、NSE、CYFRA21-1及CEA+NSE+CYFRA21-1联合检测诊断NSCLC的AUC分别为0.702(95%CI为0.560～0.843)、0.843(95%CI为0.733～0.953)、0.777(95%CI为0.652～0.901)、0.898(95%CI为0.815～0.982)。CEA、NSE、CYFRA21-1及CEA+NSE+CYFRA21-1联合检测诊断NSCLC的敏感度分别为56.25%、68.75%、71.88%及90.65%，特异度分别为95.00%、90.00%、70.00%、60.00%。见图1。

表1 各组血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平比较[μg/L，M(P25～P75)]

注：与Control组比较，*P<0.05，﹟P<0.01。

图1 血清CEA、NSE和CYFRA21-1单项及联合检测检测诊断NSCLC的ROC分析

2.3 各组miR-483-5p、miR-21、miR-25表达比较 NSCLC组miR-483-5p、miR-21表达均高于NCPD组及Control组(P均<0.05)。NSCLC组miR-25表达低于NCPD组及Control组(P均<0.05)。NCPD组与Control组miR-483-5p、miR-21、miR-25表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2。

2.4 miR-483-5p、miR-21、miR-25诊断NSCLC的ROC分析 miR-483-5p、miR-21、miR-25对NSCLC的AUC分别为0.944(95%CI为0.882 2～0.990 5)、0.966(95%CI为0.924 3～0.991 7)、0.886(95%CI为0.791 3～0.980 6)。miR-483-5p、miR-21和miR-25诊断NSCLC的敏感度分别为93.80%、84.40%、81.25%，特异度分别为90.00%、100%、95.00%。见图3。

2.5 miRNAs和CEA、NSE、CYFRA21-1及CEA+NSE+CYFRA21-1诊断NSCLC的AUC、敏感度及特异度比较 miRNA-483-5p、miRNA-21和miRNA-25诊断NSCLC的AUC均较高于单一肿瘤标志物的ROC-AUC明显增高。经χ2检验，miR-483-5p、miR-21、miR-25诊断NSCLC的敏感度与CEA+NSE+CYFRA21-1联合诊断差异无统计学意义(χ2=0.217，P=0.641；χ2=0.571，P=0.450；χ2=1.164，P=0.281)。

图2 各组miR-483-5p、miR-21、miR-25表达水平比较

图3 miRNA-483-5p、miRNA21和miRNA-25单项检测诊断NSCLC的ROC分析

3 讨论

miRNAs能够调控基因表达，起到癌基因或抑癌基因的作用，与肺癌的发生、发展密切相关。近年研究发现，miRNAs以被保护状态稳定存在于循环血液中，因此miRNAs很可能成为肺癌辅助诊断的非侵入性分子标志物。研究发现，miRNAs在诊断NSCLC方面具有较高的敏感度和特异度，但由于检测方法等多种因素的影响，不同研究者的结果差异很大，甚至相反[7～10]。我们选择3个在肺癌中具有很高敏感性的miRNAs，miR-483-5p、miR-21和miR-25作为本研究的对象，观察它们在NSCLC诊断中的价值，并与CEA、NSE、CYFRA21-1等常用的肺癌标志物作比较，为将来的临床应用提供实验基础。

研究发现，miR-483-5p通过直接靶向Rho因子鸟苷酸解离抑制因子1(RhoGDI1)和活化的白细胞黏附分子(ALCAM)，促进细胞的上皮—间质转化，从而促进肺癌的转移[11]。Toll样受体4(TLR4)/活性氧(ROS)/miR-21途径在LPS诱导的原发性肺癌生长中具有重要作用，miR-21的上调促进原代人肺癌细胞的生长，miR-21的下调则限制了原代人肺癌细胞的生长[12]。通过上调程序性细胞死亡因子4(PDCD4)可以抑制miR-21表达，从而可以减少肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭[13]。研究发现，miR-25在肺癌干细胞的祖细胞中表达是下调的，并且可能参与了支气管肺泡干细胞向肺癌干细胞的转化[14]。K-Ras突变在肺癌中经常发生，miR-25与丝裂原活化蛋白激酶(Ras-MAPK)信号通路密切相关，表明miR-25可能与肺癌的发生有关[15]。本研究结果显示，NSCLC组miR-483-5p、miR-21表达均高于NCPD组及Control组，NSCLC组miR-25表达低于NCPD组及Control组，表明NSCLC患者血清miR-483-5p、miR-21表达上调，miR-25表达下调；miR-483-5p、miR-21、miR-25对NSCLC的AUC分别为0.944、0.966、0.886，敏感度分别为93.80%、84.40%、81.25%，特异度分别为90.00%、100%、95.00%。

CEA、NSE、CYFRA21-1是临床上已常规应用于NSCLC辅助诊断的肿瘤标志物，但敏感性和特异度均有待于进一步提高。本研究结果表明，NSCLC组血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平均高于Control组，CEA、NSE、CYFRA21-1及CEA+NSE+CYFRA21-1联合检测诊断NSCLC的敏感度分别为56.25%、68.75%、71.88%及90.65%，特异度分别为95.00%、90.00%、70%、60.00%，CEA+NSE+CYFRA21-1联合检测大幅提高了NSCLC辅助诊断的敏感度。本研究发现，miR-483-5p、miR-21、miR-25诊断NSCLC的敏感度均达到了CEA+NSE+CYFRA21-1联合诊断的敏感度，表明miRNA-483-5P、miRNA21和miRNA-25作为NSCLC辅助诊断的肿瘤标志物，其在敏感度方面优于传统肿瘤标志物。

综上所述，miRNA-483-5P、miRNA21和miRNA-25可以作为非侵入性的肿瘤标志物，用于NSCLC的辅助诊断，具有很高的敏感度。