异补骨脂素对氧化应激介导骨质疏松大鼠模型的作用及机制

王军，王剑，鲁敏，牧亭亭，耿亚会

骨质疏松(OP)是临床最常见的全身性骨骼疾病，目前已成为一个全球性的健康问题[1]。OP可分为原发性和继发性2类，其中继发性占比较大，患者主要表现为骨量降低、骨组织微结构受损及骨脆性增加，易骨折，因此其致残率较高，给患者日常生活带来严重影响[2-3]。不少研究证实，氧化应激(OS)是引发OP的根本原因之一，糖皮质激素会导致机体OS反应，使生理功能受阻，长期大剂量的糖皮质激素使用会诱发继发性OP[4-5]。临床上治疗OP常采用抗骨吸收或促骨形成类药物，但其对OS介导的OP疗效并不理想，因此从抗OS方面寻求新型治疗OP的药物十分重要[6]。异补骨脂素是一种从豆科植物中提取的香豆素类化合物，具有防治OP的作用[7]。本研究通过动物实验，探讨异补骨脂素对OS介导的OP的治疗效果，以期为其防治提供新的思路，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物： 健康大鼠[动物批准号：SCXK(京)2018-0013]40只，雌性，月龄8个月，体质量(210±10)g，均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于清洁级实验室中，所有大鼠自由摄食饮水。

1.1.2 试药试剂： 骨钙素(OCN)、骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、骨保护素(OPG)、可溶性核因子κB受体活化因子配体(sRANKL)及抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)试剂盒由英国IDS公司提供，过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)检测试剂盒均由宁波博泰生物技术有限公司提供，β-catenin抗体、FoxO3a抗体和Axin2抗体均由美国Santa Cruz公司提供，Trizol总RNA提取试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司，Western-blot及凝胶电泳试剂均购自南京凯基生物有限公司，醋酸泼尼松购自浙江仙琚制药股份有限公司，异补骨脂素购自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.1.3 仪器设备：骨密度仪(XR-46型，美国 NORLAND公司生产)、电子天平(AEL-40SM型，日本岛津公司生产)、半自动图像分析仪(BioDent/OsteoProbe型，美国OsteoMesure公司生产)、全自动酶标仪(Read Max 1900Plus型，上海闪谱生物科技有限公司生产)、MTS材料测试系统(858 Mini Bionix型，美国MTS公司生产)、显微镜(Olympus IX71型，日本OLYMPUS公司生产)、电泳仪(Bio-RaD型，美国Bio-Rad公司生产)、离心机(Allegra 64R型，美国贝克曼库尔特公司生产)。

1.2 造模与分组 2017年9月—2018年10月在内蒙古自治区人民医院动物实验室进行实验， 健康大鼠40只随机数字表法分为模型组和干预组，各20只。醋酸泼尼松以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制成0.5 mg/ml浓度的药液，2组大鼠每日给予10 ml·kg-1·d-1，灌胃，连续14周。自造模之日起，干预组大鼠每日上午给予醋酸泼尼松，下午给予异补骨脂素混悬液25 mg·kg-1·d-1，每周停1天，连续治疗14周，期间密切观察各组大鼠的生理反应及生活情况。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 血清骨转换指标检测： 14周时各组大鼠末次灌胃后，禁食24 h，10%水合氯醛腹腔麻醉后，右心室彻底抽血处死，血标本离心取上清，-80℃备存待测。ELISA 法检测各组大鼠血清BAP、OCN、TRACP5b、sRANKL和 OPG水平，严格按照说明书操作要求进行。

1.3.2 骨样本留取：大鼠处死后，取两侧股骨、两侧胫骨和第4腰椎体(L4)，剔除周围附着的肌肉及筋膜后，采用0.9%氯化钠溶液冲洗，医用纱布包裹，外面包裹一层锡纸，-80℃备存待测。

1.3.3 骨组织氧化应激水平检测：将胫骨样本采用磷酸缓冲盐溶液(PBS)灌洗至骨干变白，收集灌洗液，离心后PBS重悬，调整骨髓细胞密度为2×106/ml，接种在6孔板中，无血清培养液37℃下培养箱内孵育30 min，采用DCFH-DA荧光探针进行氧化应激水平检测。

1.3.4 骨密度及骨组织形态计量学分析：(1)骨密度。采用骨密度仪对各组大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度进行检测；(2)骨组织形态计量学分析。取右侧股骨样本解冻后，置于MTS试验机上采用三点弯曲法进行生物力学检测[8]，通过仪器记录弹性载荷、弯曲能量、断裂载荷，并计算刚性系数。

1.3.5 骨组织FoxO3a、Axin2及β-catenin蛋白表达水平检测：取右侧股骨样本解冻后，碾碎倒入匀浆器，加入裂解液混匀，按照Trizol总RNA 提取试剂盒说明书进行操作，提取总蛋白，-80℃下冻存;将总蛋白溶入等体积的缓冲液中煮沸10 min，经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离蛋白，然后转印到PVDF膜上，置入封闭液中摇动1 h，加入一抗(PFoxO3a、β-catenin和Axin2抗体均为1∶500稀释)孵育，4℃下过夜。二抗孵育(1∶2 000稀释)2 h，免疫荧光增强法显色，采用Western-blot法检测骨组织FoxO3a、Axin2及β-catenin蛋白表达，以其与GAPHD的灰度比值表示。

2 结 果

2.1 2组大鼠血清骨转换指标比较 与模型组比较，干预组大鼠14周后的BAP、OCN、OPG明显升高，sRANKL和TRAP5b明显下降(P<0.01)，见表1。

2.2 2组大鼠骨组织氧化应激水平比较 干预组大鼠CAT及SOD水平明显高于模型组，MDA水平明显低于模型组(P<0.01)，见表2。

表2 2组大鼠骨组织氧化应激水平比较

2.3 2组大鼠的骨密度情况比较 14周后，干预组大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型组(P<0.01)，见表3。

表3 2组大鼠的骨密度比较

2.4 2组大鼠骨生物力学性能比较 三点弯曲检测大鼠股骨干的生物力学参数，结果显示，干预组大鼠的弹性载荷、弯曲能量、断裂载荷及刚性系数较模型组明显上升(P<0.01)，见表4。

表4 2组大鼠骨生物力学性能比较

2.5 2组大鼠骨组织FoxO3a、Axin2及β-catenin蛋白表达比较 与模型组大鼠比较，干预组FoxO3a和Axin2蛋白水平下调，β-catenin蛋白表达明显增加(P<0.01)，见表5、图1。

表5 2组大鼠骨组织相关蛋白表达水平情况比较

表1 2组大鼠血清骨转换指标比较

注：1～4为模型组，5～8为干预组

3 讨 论

OP是在老年人群中发病率较高的一种全身性骨骼疾病，并给老年人生活质量带来严重影响。近些年衰老的“OS理论”在肝病、肾病、心血管疾病及肿瘤等疾病的研究中被广泛应用，但在OP方面尚处于初步研究阶段[9]。机体衰老时，代谢系统会产生较多的前氧化剂，从而对机体细胞产生氧化损伤，当其损伤积累到一定程度时，会发生OS反应，最终导致机体发生与衰老相关的退行性疾病。骨组织属于人体第三大最易衰老组织，OS会对骨髓干细胞分化成骨细胞产生抑制，同时会促进破骨细胞的分化，从而诱导OP的发生[10-11]。长期大量使用糖皮质激素会导致机体高OS状态，从而导致继发性OP。大鼠是OP动物模型最常用的动物，其模型具有稳定性好、重复性高的优点，利于学者对OP的发生机制及防治进行探索。本研究通过醋酸泼尼松诱导建立OS介导OP大鼠模型进行实验研究，对研究人类OS介导 OP有着积极的指导意义。

寻找和筛选中药中抗氧化及衰老的成分研究一直来都是热点。天然抗氧化剂在植物中存在繁多的种类，在各种慢性病的防治方面有着重要作用[12]。异补骨脂素是从豆类植物中提取的一种化学活性成分，具有温脾止泻及温补肾阳功效，现代药理研究认为，异补骨脂素可促进成骨细胞增殖，抑制骨吸收[13]。OCN是由成骨细胞分泌的一种功能性蛋白，可反映机体成骨细胞的活动状态[14]。BAP主要存在于机体肝脏和骨骼上，是成骨细胞的表型标志物之一[15]。OPG为破骨细胞分化因子的诱导受体，可减少破骨细胞的产生[16]。本研究结果显示，干预组大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型组，干预组大鼠的BAP、OCN、OPG明显升高，sRANKL和TRAP5b明显下降(P<0.01)。这说明异补骨脂素可能发挥类似雌激素作用，促进雌激素受体阳性细胞增殖，调节成骨分化，从而维持骨密度，并促进成骨细胞产生，缓解OP症状。

骨折是OP的严重并发症，通过检测骨组织力学特征，可有效评价OP的严重程度[17]。本研究通过股骨三点弯曲试验，结果显示，干预组大鼠的弹性载荷、弯曲能量、断裂载荷及刚性系数较模型组明显上升(P<0.01)，说明经过异补骨脂素治疗，可抵消OS介导OP对骨生物力学的硬性，增强大鼠的骨组织抵抗变形能力，提高其骨生物性能，降低骨折的发生风险。机体在新陈代谢过程中会产生活性氧自由基(ROS)，在正常状态时，机体内抗氧化剂和各种酶与ROS呈一个动态的平衡，当这种平衡被打破时，会发生OS反应，从而使纤连蛋白和胶原降解，对成骨细胞的正常分化产生抑制，并加速机体衰老[18]。SOD是机体内可清除超氧阴离子的一种抗氧化酶，可起到抗氧化作用[19]。CAT是一种可催化过氧化氢，分解成氧和水的酶，是过氧化物酶体的标志酶，是其他巯基蛋白质的保护剂[20]。MDA是ROS与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的一种代谢终产物，其可以反映机体受ROS攻击的严重程度[21]。本研究结果显示，干预组CAT及SOD水平明显高于模型组，MDA水平明显低于模型组(P<0.01)。这是因为异补骨脂素具有抗氧化作用，可有效清除机体内过多的ROS，从而对维持细胞内环境稳定起到重要作用，逆转OS反应，减轻机体受氧化损伤的程度。

FoxO是一种可调控OS的最重要蛋白，可包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4及FoxO6，其中FoxO3a在骨组织中广泛存在[22]。Wnt信号通路在成骨细胞分化和增殖中起重要作用，β-catenin蛋白是Wnt信号通路的主要成分，可启动Wnt信号通路[23]。Axin2是一种可抑制Wnt 信号通路激活的骨架蛋白[24]。本研究显示，干预组FoxO3a和Axin2蛋白水平下调，β-catenin蛋白表达明显增加(P<0.01)。这可能是因为OS会促进FoxO3a通路激活，并加重OS，同时引起成骨组织细胞凋亡，抑制成骨分化功能，异补骨脂素通过抗氧化作用，可抑制FoxO3a信号通路激活；同时上调β-catenin蛋白表达，使其与FoxO3a结合，启动调节骨组织细胞凋亡及清除 ROS的转录程序，促进成骨细胞的形成和骨形成，通过清除过多的ROS，实现对Axin2的表达下调，抑制Axin2/PPARγ信号通路参与脂质代谢，阻断Axin2对Wnt信号通路的抑制，起到防治OP的作用。

综上所述，OS会引起并促进OP的病理进程，而异补骨脂素可通过抗氧化作用，调控FoxO3a/Wnt信号通路发挥OS介导OP的作用。

利益冲突：无

作者贡献声明

王军：整理资料，分析资料，撰写论文；王剑：修改总指导；鲁敏：收集整理资料，分析数据，图表设计；牧亭亭、耿亚会：参考书籍查找，收集资料