PECAM-1和VCAM-1在侵入性胎盘患者血清及胎盘组织中的表达及意义

宋学薇，刘亚梅，孙佳，胡鑫，纪江海

从2005年到2011年，我国的侵入性胎盘(胎盘植入、增生和萎缩)的发病率增加了30%。侵入性胎盘的临床危险因素包括前置胎盘和子宫手术史[1-3]。目前，侵入性胎盘的诊断主要依靠产前超声诊断，尚无母体胎盘或血清标志物对侵袭性胎盘具有高度敏感性[4-5]。侵入性胎盘即绒毛膜绒毛直接附着或侵入子宫肌层，在分娩中发生率为1∶2 500，并且在过去的50年中发病率增加了10倍。侵入性胎盘的病理学基础是蜕膜基底缺损。血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)是分泌的剪接变体，其可结合循环血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子，导致其活性降低，被认为在先兆子痫的发病机制中起抑制作用[6-7]。血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)属于细胞因子可诱导的免疫球蛋白样(Ig样)超家族，是结合白细胞整联蛋白的受体样膜结合蛋白。巨噬细胞-1抗原(Mac-1)和淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)是VCAM-1的配体，且晚期抗原激活-4亦是VCAM-1配体。循环可溶性细胞黏附分子由mRNA的交替剪接或膜结合蛋白形式的蛋白水解产生[8]。由于内皮激活，在患有感染、癌症和自身免疫疾病的患者中发现VCAM-1水平增加[9-10]。因此，VCAM-1浓度反映了内皮细胞炎性水平。本研究拟探讨PECAM-1和VCAM -1在侵入性胎盘组织中的表达及意义，为侵入性胎盘的早期诊断及治疗提供理论及临床依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2009年2月—2016年12月河北省沧州市人民医院妇产科单胎足月妊娠分娩并建立生产档案的产妇共276例，其中侵入性胎盘138例(植入性胎盘 68例、粘连性胎盘70例)作为侵入性胎盘组，无侵入性胎盘138例作为正常胎盘组。正常胎盘组孕妇年龄22～32(26.9±4.0)岁，BMI 20.1～27.2(23.7±3.1)kg/m2，孕次1～3(1.3±0.4)次，孕期36～40(38.0±2.9)周；侵入性胎盘组年龄22～33(27.1±5.7)岁，BMI 20～26(23.8±3.9)kg/cm2，孕次1～3(1.4±0.3)次，孕期36～41(38.3±3.0)周；2组年龄、BMI、孕次、妊娠周数等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究得到医院伦理委员会的批准，所有入选对象均知情同意并签署知情同意书，自愿提供胎盘组织和血清。

1.2 选择标准 纳入标准：(1)入组孕妇均未出现全身性疾病，不存在胎儿宫内发育迟缓。(2)侵入性胎盘均符合Gielchinsky 2002年提出的侵入性胎盘诊断标准[11]。

排除标准：采用辅助生殖技术受孕者；近3个月有手术、创伤史；排除合并胎膜早破、围产期心肌病、妊娠期高血压、糖尿病等病史的产妇；早产胎膜破裂，前置胎盘或产前出血的妇女，有感染证据(胎盘的组织病理学检查)，高血压疾病或母体合并症。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 血清及胎盘中PECAM-1和VCAM-1 mRNA表达水平的测定：使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从血清及胎盘中提取RNA，并使用Nanodrop ND 1000分光光度计(NanoDrop technologies Inc，Wilmington，DE)定量，根据制造商指南，使用Superscript VILO cDNA合成试剂盒(Life Technologies)将0.2 μgRNA转化为cDNA。对PECAM-1和VCAM-1进行taqman基因表达测定。PECAM-1的引物序列：正向引物5'-GGAGGAGGAGATTGAGCACAACA-3'，反向引物5'-AGCGGTACAGCTGCTTGAAC-3'。VCAM-1的引物序列：正向引物5'-CTCCTGCGAAACCTCAGTG-3'，反向引物5'-GACGATGGTGACGTTGATGT-3'。硝酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物序列：正向引物5'-ACAATCAGAGGTGAGCACTGCAA3'，反向引物5'-TCCGAGCCTGAAAGTTAGCAA-3'。使用FAM标记的Taqman通用PCR mastermix(Life Technologies)在CFX 384(Bio-Rad，Hercules，CA)上进行RT-PCR，运行条件：50℃ 2 min；95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min(40个循环)。反应体系为：正向引物10 μl、反向引物10 μl、RNA模版0.6 μl、超级酶混合物0.2 μl、2×μByr。GAPDH作为内部对照将所有数据标准化，并针对对照样品的平均Ct进行校准。利用2-ΔΔCt公式计算mRNA表达量。

1.3.2 胎盘中PECAM-1和VCAM-1蛋白表达水平的测定：将胎盘组织样品用福尔马林固定并石蜡包埋。将切片以5 μm切割，脱蜡，在二甲苯中脱蜡，并通过一系列梯度醇再水合。将样品放入柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，在微波炉中煮沸20 min以进行抗原修复。用0.3%氢过氧化物酶封闭内源性过氧化物酶30 min，然后在5%山羊血清中孵育60 min以防止非特异性抗原。然后将载玻片与第一抗体在4℃温育过夜。使用以下一抗和稀释液：用于PECAM-1的小鼠单克隆抗体(AF1086,1∶40;R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)，用于VCAM-1的兔单克隆抗体(ab174838,1∶100;Abcam，Cambridge，UK)及用于PECAM-1和VCAM-1的小鼠单克隆二抗体(ab20034,1∶100;Abcam； CTS 008;R&D Systems)。用Histofine SAB-PO(Nichirei)检测PECAM-1、VCAM-1二抗抗体结合。施加与山羊抗小鼠免疫球蛋白缀合的第二过氧化物酶标记的聚合物60 min。在3,3-二氨基联苯胺中开发并用Mayer苏木精复染。每个载玻片通过梯度醇脱水并用盖玻片覆盖。阳性细胞的判定由病理科医师以盲法确定。PECAM-1、VCAM-1表达主要位于细胞质中。染色强度评分：0分，表示无染色；1分，弱染色；2分，中度染色；3分，强染色。细胞染色细胞百分比评分： 0分，0～4%细胞染色；1分，5%～29%细胞染色；2分，30%～59%细胞染色；3分，60%～100%。将细胞染色数量和染色强度评分的值相乘，得到范围为0～9的结果。

1.3.3 血清中PECAM-1和VCAM-1蛋白表达水平检测：PECAM-1、VCAM-1蛋白表达采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定， ELISA试剂盒购自武汉华美生物科技有限公司，严格按照ELISA试剂说明书进行操作。

2 结 果

2.1 2组胎盘组织中PECAM-1、VCAM-1 mRNA表达水平的比较 侵入性胎盘组PECAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表达水平高于正常胎盘组(P<0.01)，见表1。

表1 2组胎盘组织中PECAM-1、VCAM-1 mRNA表达水平比较

2.2 2组胎盘组织中PECAM-1、VCAM-1 蛋白表达评分比较 侵入性胎盘组PECAM-1、VCAM-1蛋白表达评分高于正常胎盘组(P<0.01)，见表2。

表2 2组胎盘组织中PCAM-1、VCAM-1蛋白表达水平比较

2.3 2组胎盘组织中PECAM-1、VCAM-1蛋白表达阳性率比较 侵入性胎盘组PECAM-1、VCAM-1蛋白表达阳性率高于正常胎盘组(P<0.01)，见表3，图1见封3。

表3 2组胎盘组织中PECAM-1、VCAM-1蛋白表达阳性率比较 [例(%)]

2.4 2组血清PECAM-1、VCAM-1 mRNA表达比较 侵入性胎盘组血清PECAM-1、VCAM-1 mRNA表达水平高于正常胎盘组(P<0.01)，见表4。

表4 2组血清PECAM-1、VCAM-1 mRNA表达水平比较

2.5 2组血清PECAM-1、VCAM-1蛋白表达水平比较 侵入性胎盘组血清PECAM-1、VCAM-1 蛋白表达水平高于正常胎盘组(P<0.01)，见表5。

表5 2组血清PECAM-1、VCAM-1蛋白表达水平比较

3 讨 论

二维和三维彩色多普勒超声在侵入性胎盘患者的产前诊断中具有82%～100%的灵敏度和92%～97%的特异度。侵入性胎盘的超声特征包括在胎盘内存在不规则形状的胎盘腔隙，覆盖胎盘的子宫肌层变薄，失去双季节性“超声波线”，胎盘向膀胱凸出，增加子宫浆膜—膀胱界面的血管分布。在正常妊娠中，绒毛外滋养细胞侵入蜕膜，胎儿来源的内皮化滋养层代替母体螺旋小动脉血管内皮，导致螺旋动脉重塑为低阻力血管，其通常对血管控制无反应。如果滋养细胞增殖过多，则易发生胎盘侵袭，通过蜕膜进入子宫肌层和邻近的盆腔器官，在某些情况下导致分娩时发生严重出血，威胁母体及胎儿生命。当胎盘植入子宫瘢痕血管部位时，尤易发生过度侵袭。虽然滋养细胞侵袭的分子机制复杂，但先前的细胞培养和免疫组织化学研究表明PECAM-1可抑制滋养细胞的侵袭。

PECAM-1在先兆子痫中高表达。早发性先兆子痫与浅胎盘和胎盘低灌注有关，导致高PECAM-1表达，诱导胎盘缺氧和梗死，最终显现出蛋白尿和高血压的临床表型。相反，侵入性胎盘导致深度植入和过度灌注，同时促进局部PECAM-1表达[9-10]。PECAM-1是通过其与浸润的白细胞上存在的整联蛋白(晚期抗原-4)的相互作用参与炎性细胞的迁移和募集的黏附分子。研究发现环氧合酶-2(COX-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和诱导型NO合成酶(iNOS)在侵入性胎盘组织中的表达水平发生了改变，与对照胎盘组相比，侵入性胎盘中COX-2和iNOS水平明显增加，其可能通过减少胎儿血流和增加胎儿血液循环中流动阻力加重疾病的严重程度[11-12]。本研究结果显示，侵入性胎盘患者血清及胎盘组织中PECAM-1 mRNA、蛋白表达水平升高，这与上述研究符合，同时也提示，PECAM-1水平升高导致滋养细胞过度增殖，这与侵入性胎盘发病机制密切相关。最新研究发现，血小板和中性粒细胞也通过促进母体胎盘血管损伤参与侵入性胎盘的病理生理学改变。并且这些细胞的募集可能是由细胞黏附分子介导的[13-14]。免疫细胞进入绒毛被认为是由PECAM-1介导的，黏附分子在妊娠的正常发育中发挥作用，并且侵入性胎盘中黏附分子的分析将为澄清侵入性胎盘的病理生理学提供有用的信息。

VCAM-1是一种有效的血管生成生长因子，可促进血管生成、一氧化氮和血管扩张性细胞因子的分泌。在正常妊娠中，VCAM-1促使内皮健康和血管舒张、支持胎盘发育所必需的血管生成。VCAM-1不可逆地与循环VEGF结合，阻止其与内皮细胞受体结合并表达其生理作用。VEGF支持内皮健康和血压调节，能促进滋养细胞增殖生长。VCAM-1是通过其与浸润的白细胞上存在的整联蛋白(晚期抗原-4)的相互作用参与炎性细胞的迁移和募集的黏附分子[15]。用阻断VCAM-1的贝伐单抗作用于滋养细胞可有效地抑制其生长。VCAM-1在啮齿动物中的低表达产生了先兆子痫模型，其特征在于高血压、蛋白尿和内皮细胞增生的特征性肾小球变化[16-17]。受影响的动物可通过VEGF抑制剂治疗获救。研究报道，在先兆子痫妊娠中，VCAM-1在胎盘中呈明显低表达[18-20]。虽然人类和动物研究支持VCAM-1在先兆子痫中的致病作用，但VCAM-1降低在侵入性胎盘中的作用尚不清楚。本次研究结果显示，侵入性胎盘患者血清及胎盘组织中VCAM-1 mRNA、蛋白表达水平升高，导致螺旋动脉血管损伤以及胎盘炎性反应，其与侵入性胎盘发病机制密切相关。

综上所述，侵入性胎盘患者血清及胎盘组织中PECAM-1 mRNA、蛋白表达水平，VCAM-1 mRNA、蛋白表达水平升高，导致滋养细胞过度增殖，螺旋动脉血管损伤以及胎盘炎性反应，这与侵入性胎盘发病机制密切相关。

利益冲突：无

作者贡献声明

宋学薇：设计研究方案，实施研究过程，进行统计学分析，论文撰写；刘亚梅：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；孙佳：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；胡鑫、纪江海：参与研究过程，数据收集，分析整理