氧化型低密度脂蛋白与急性冠状动脉综合征患者CD4+T细胞Notch1、Notch2表达的相关性研究

朱家平，朱李茹

（襄阳市中心医院，湖北文理学院附属医院医学检验部，襄阳 441021）

冠心病是指由于冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄甚至堵塞，导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病，在中医学中属于“胸痹”“心痛”“真心痛”等范畴[1]。中医学对冠心病的治疗积累了丰富的临床经验。目前益气养阴、活血化瘀治疗冠心病的疗效已被包括西医在内的医学界所确认。目前，中药在临床上的应用越来越广泛，其中茶色素治疗冠心病患者能够抑制体内低密度脂蛋白的氧化，降低了患者血浆中氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）的水平[2]。近期研究发现，冠心病患者或动物模型均出现辅助性T细胞（Th）的异常活化，主要是促炎的Th1升高及抗炎的Th2降低，然而出现这种现象的机制尚未阐明[3-5]。ox-LDL是冠心病发生的主要风险因素，ox-LDL在血管内膜上的堆积会诱导内皮细胞炎性反应，导致其分泌炎性因子和趋化因子，进一步引起炎症因子释放和免疫激活[6-7]。有研究报道，ox-LDL可诱导Th1细胞分化[8]，而Notch信号传导介导T细胞的分化过程[9]。因此，笔者探讨了ox-LDL与急性冠状动脉综合征（ACS）患者CD4+T细胞Notch1、Notch2表达的相关性。

1 资料及方法

1.1 主要试剂 人源ox-LDL（北京协生生物科技有限公司，批号：SY0441）；APC标记小鼠抗人Notch1、PE标记小鼠抗人Notch2单抗（Sigma公司）；白细胞介素 4（IL-4）-PE、干扰素 γ（TNF-γ）-PE（Sigma公司）；人源ox-LDL ELISA试剂盒（武汉华美生物有限公司，批号：ab14526-65）。

1.2 研究对象 收集2016年3月—2017年10月本院确诊的冠心病患者88例，男49例，女39例，平均年龄为（53.64±11.43）岁，其中[ACS患者56例，急性心肌梗死（AMI）患者26例，不稳定型心绞痛（UA）患者 30例]，稳定型心绞痛（SA）患者 32例，另外纳入同期健康体检者30例，男17例，女13例，平均年龄为（54.64±12.63）岁。患者组与对照组之间年龄和性别无统计学差异（P＞0.05），具有可比性。同时排除出现感染性疾病、癌症、血液系统疾病、自身免疫性疾病、近期服用非甾体抗炎药或免疫抑制剂的人群。并且每位纳入对象均签署知情同意书。

1.3 血浆ox-LDL水平分析 将血浆标本放置室温平衡，按照ELISA试剂盒说明书进行试验。

1.4 流式细胞术分选CD4+T细胞 采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离外周单个核细胞[10]。将分离的外周血单个核细胞培养5 h，弃去贴壁细胞，便得到淋巴细胞。调整细胞密度为1×107，加入Percp/cy 5.5标记小鼠抗人CD3、FITC标记小鼠抗人CD4抗体，室温避光孵育0.5 h，PBS清洗2遍，重悬后流式细胞仪分选CD4+T细胞。并采用流式细胞术对Th1、Th2细胞进行计数。

1.5 流式细胞术检测CD4+T细胞Notch表达 从健康人群中分离得到CD4+T细胞接种于6孔板，随机将细胞分为4组，及对照组、低、中、高剂量ox-LDL 组（40、80、160 mg/L），每组设置 3个复孔。共孵育72 h后，磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗2遍，每组细胞再分为两组，分别加入浓度为0.2 g/L的APC标记小鼠抗人Notch1、PE标记小鼠抗人Notch2单抗，室温避光反应0.5 h，PBS清洗后离心、重悬，进行流式细胞术检测Notch1、Notch2表达。

1.6 数据分析 计量资料采用SPSS 20.0软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用构成比表示，组间比较采用卡方检验，相关性采用Pearson分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般临床资料比较 4组研究对象在年龄、性别、高血压、糖尿病、吸烟及HDL-C水平等方面均无统计学差异（P＞0.05）。与对照组相比，UA组和AMI组患者TC、TG及LDL-C水平显著升高（P＜0.05），而SA组与对照组相比无统计学差异，UA组与AMI组相比也无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

2.2 各组CD4+T细胞Notch1和Notch2表达、Th1/Th2比值及ox-LDL水平 UA组、AMI组CD4+T细胞Notch1、Notch2表达相对于对照组显著降低（P＜0.05），而Th1/Th2比值及ox-LDL水平相对于对照组显著升高（P＜0.05）。CD4+T细胞Notch1和Notch2表达、Th1/Th2比值及ox-LDL水平在SA组和对照组之间相比无明显差异，UA组与AMI组相比也无统计学差异（P＞0.05），见表2。经Pearson相关性分析发现，ACS患者（UA组、AMI组）外周血ox-LDL与Notch1（r=-0.653，P＜0.01）、Notch2（r=-0.468，P＜0.01）表达呈明显负相关，与Th1/Th2比值呈明显正相关（r=0.582，P<0.01）。见图 1。

表1 各组患者一般临床资料Tab.1 General clinical data of patients of each group

表2 各组CD4+T细胞Notch1和Notch2表达、Th1/Th2比值及 ox-LDL水平（x±s）Tab.2 Expression of Notch1，Notch2 in CD4+T cells，Th1/Th2 ratio and levels of ox-LDL in each group（x±s）

2.3 ox-LDL对ACS患者CD4+T细胞Notch表达的影响 采用ox-LDL刺激流式分选的人外周血CD4+细胞72 h，对照组、低、中、高剂量ox-LDL组中Notch1 表达分别为（1.05±0.25）%、（0.84±0.23）%、（0.62±0.17）%及（0.31±0.14）%，与对照组相比，低、中、高剂量ox-LDL组均显著降低（P＜0.05）。除此之外，对照组、低、中、高剂量ox-LDL组中 Notch2表达分别为（8.26±1.43）%、（5.34±1.30）%、（3.27±0.85）%及（1.39±0.64）%，与对照组相比，低、中、高剂量ox-LDL组均显著降低（P＜0.05）。见图2。

3 讨论

图1 各指标相关性分析Fig.1 Correlation analyses of each indicator

图2 ox-LDL对CD4+T细胞Notch表达的影响（x±s）Fig.2 Effects of ox-LDL on the expression of Notch in CD4+cells（x±s）

冠心病属于多因素的大动脉炎性病变，而炎症反应和免疫应答起着关键性作用。CD4+T细胞依据分泌的细胞因子和功能不同分为Th1和Th2亚群，Th1主要生理作用是诱导细胞免疫和免疫调节。Th2的主要生理作用是促使体液免疫和免疫调节，并且Th1/Th2比例失衡会诱导自身免疫性疾病的发生[11]。本研究用白细胞介素 4（IL-4）-PE、干扰素 γ（TNF-γ）-PE分别作为Th1和Th2细胞的标志，结果提示ACS患者Th1/Th2比值相对于对照组显著升高。说明ACS患者存在Th1/Th2比例失衡，机体内环境的稳态受到破坏，这可能与ACS患者细胞免疫功能紊乱和细胞介导的免疫病理过程相关。

ox-LDL是导致冠心病发生发展的一个重要因素，由于ox-LDL的过度表达会导致内皮细胞、巨噬细胞及CD4+T淋巴细胞凋亡的发生[12]。ox-LDL在引起动脉粥硬化过程中，会导致斑块不稳定，提出冠心病患者血浆中ox-LDL水平的升高，代表着ACS的出现，并且ox-LDL水平与ACS病情有着密切联系。本研究发现ACS患者ox-LDL水平相对于健康对照组显著升高，早期研究表明ox-LDL能明显诱导巨噬细胞Notch1受体的表达，提示Notch信号通路参与冠心病的发生[13]。ox-LDL作用机制主要通过TLR2/4受体活化巨噬细胞，诱导Notch配体Jagged1上调，产生大量促炎因子。研究发现UA组、SA组CD4+T细胞Notch1、Notch2表达相对于健康对照组显著降低；相关性分析发现ACS患者外周血ox-LDL与Notch1、Notch2表达呈明显负相关，与Th1/Th2比值呈明显正相关。

接着在体外研究了ox-LDL刺激对分离出的CD4+T细胞Notch1、Notch2表达的影响，结果表明低、中、高剂量的ox-LDL均能明显抑制Notch1、Notch2的表达。动物实验发现，Notch2信号可诱导Th2的分化，Notch1/Notch2信号通路可诱导GATA-3和IL-4的上调来促使Th2的分化，而不是作用于IL-4/STAT6信号通路[14]。早期研究也发现中药参参康心能诱导Notch信号通路活化，进而对冠心病气虚血疲证小鼠具有保护作用[15]。由此可推测，参参康心可能是通过促使Notch信号传导，诱导辅助性T细胞向抗炎的Th2细胞分化，机体起着免疫调节作用，进而缓解了冠心病气虚血疲证小鼠的症状。综上所述，ox-LD可抑制Notch1/Notch2的表达来降低Th2的分化，并且Th2与Th1在体内相互作用，抑制Th2分化，便是促使Th1的分化。总之，ox-LDL能明显抑制人外周血CD4+T细胞Notch1、Notch2分子表达，可能与ox-LDL抑制Th2分化而促进Th1异常分化有关，参与冠心病的发生发展。