沙门菌马流产凝集试验阳性血清国家参考品的制备及标定

王秀丽,魏财文,张 媛,彭国瑞,李 建,辛凌翔,张一帜,蒋玉文

(中国兽医药品监察所,北京 海淀100081)

马沙门菌病的病原主要为马流产沙门菌,由于感染动物的年龄、性别不同,其临床症状也不一致,孕马主要表现为流产;幼驹感染后发生败血症、关节炎和腹泻,有时出现支气管肺炎;公马表现为睾丸炎、鬓甲肿等。该病发生于世界各地,国内主要发生在种马场[1]。该病的诊断主要靠沙门菌马流产凝集试验,根据我国农业行业标准和出入境检验检疫行业标准的相关规定进行检验。沙门菌马流产凝集试验阳性血清国家参考品的制备和标定对于沙门菌马流产凝集试验抗原及阳性血清、阴性血清的生产及成品和半成品的检验具有重要意义。

本研究按照2015 版《中国兽药典》和《中华人民共和国兽用生物制品规程》二〇〇〇版的有关规定及国家对标准物质研究的相关要求,结合以往沙门菌马流产凝集试验阳性血清参考品制备、标定的经验,进一步规范了沙门菌马流产凝集试验阳性血清国家参考品的制备、标定方法和质量标准。

1 材料与方法

1.1 菌种及试剂 马流产沙门菌C77-1 株,由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应,沙门菌马流产凝集试验抗原国家参考品,效价为1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 的沙门菌马流产凝集试验阳性血清参考品由中国兽医药品监察所制备和标定,普通琼脂、普通肉汤、TG、TSB 培养基,购自北京中海生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制备 开启冻干菌种,用1 mL 普通肉汤溶解后,用接种环取少量菌液划线接种普通琼脂平板,37 ℃培养24 h,选取光滑的典型菌落接种于普通琼脂斜面,37 ℃培养20~24 h,对菌种进行检定[2,3],挑取检定合格的种子接种普通琼脂斜面中管若干支,经肉眼检查纯粹后,每只中管加入6~8 mL 生理盐水将菌体洗下,收集到含有灭菌玻璃珠的250 mL 的分装瓶中,按照菌液总量的1%加入甲醛溶液,摇碎菌块,用灭菌纱布漏斗过滤后置于37 ℃灭活24 h,无菌检验合格后用细菌比浊标准管调整菌液浓度至1.0×1010CFU/mL[3]。

1.2.2 免疫程序 用制备好的抗原以0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL 分3 次静脉注射体重为1.5~2.0 kg的健康家兔15 只,每次免疫时间间隔为5~6 d,最后1 次免疫后5~7 d 后每只兔子耳动脉采血2 mL,分离血清,测定每只兔子的血清效价,兔子血清效价不低于1∶6 400 时可以采血。

1.2.3 血清效价测定 常量法:将待检血清、效价为1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 阳性血清参考品及阴性血清各1 份,分别作1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400……1∶6 400稀释。取各稀释度血清1.0 mL 于1 支试管,每管加入1∶20 稀释的沙门菌马流产凝集试验抗原国家参考品1.0 mL。另将1∶20 稀释的沙门菌流产凝集试验抗原国家参考品1.0 mL 加入1.0 mL 生理盐水中作为对照,以观察抗原是否自凝。将各组试管振摇混匀,置37 ℃反应20 h 后室温静置2 h[4]。

抗原国家参考品与效价标识为1 ∶1 600、1∶3 200、1 ∶6 400 的阳性血清参考品,在其最终稀释度分别为1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 均出现不低于“++”凝集,而在其最终稀释度分别为1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800 均出现“+”或“-”凝集;与最终稀释度为1∶200 的阴性血清不发生凝集,并在生理盐水对照管中不自凝时,试验结果有效。

微量法:在96 孔U 型反应板的第1 列分别加入200 μL 1∶100 倍稀释的待检血清,3 种效价的阳性血清参考品和阴性对照血清,第2~9 列分别加入100 μL 5%苯酚生理盐水,从第1 列中吸取100 μL 的血清依次2 倍系列稀释至第8 列,吸弃100 μL,第9 列作为抗原对照,分别加入1∶20 稀释的沙门菌马流产凝集试验抗原国家参考品100 μL,充分混匀后置37 ℃反应20 h 后室温静置2 h。判定结果。

1.2.4 沙门菌马流产凝集试验阳性血清国家参考品候选物的制备 兔子血清效价不低于1∶6 400 以后,心脏采血,分离血清,将血清混匀后按照1.2.3的方法测定混合血清的效价,同时用200 μL 的体系测定微量凝集效价。混合血清按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

将无菌检验合格的效价为1∶6 400 的血清与健康兔血清1∶1混合,配制成效价为1∶3 200 的阳性血清参考品候选物,将效价为1∶6 400 的血清与健康兔血清1∶3混合配制成效价为1∶1 600 阳性血清参考品候选物,效价为1∶6 400 的混合血清直接作为1∶6 400 的阳性血清参考品候选物,分别配制2.0 mL,将配制的阳性血清候选物按1.2.3 的方法测定效价。

效价测定结果与预期血清效价结果一致后,按以上比例配制阳性血清国家参考品,按照血清总量的0.01%加入硫柳汞。1.0 mL/支分装于安瓿瓶中,按照特定的冻干曲线冻干,抽真空封口。

1.2.5 成品检验 按照《中国兽药典》中对沙门菌马流产凝集试验阳性血清的质量标准及标准物质的相关规定,该阳性血清参考品的质量标准为:1 性状 本品为疏松物质,加生理盐水后迅速溶解;2 无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验,应无菌生长;3 效价测定 按照1.2.3 测定血清的效价,血清效价测定结果应与标识的血清效价结果一致;4 剩余水分测定 按现行《中国兽药典》附录进行测定,应小于3.0%;5 真空度测定 按现行《中国兽药典》附录进行测定,应符合规定;6 均一性 效价为1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400的血清成品各随机抽取3 支,按1.2.3 项进行效价测定,3 种血清效价应与前一批次对应效价的阳性血清参考品(1 ∶1 600、1 ∶3 200、1∶6 400)效价均一致,且每种效价的血清的3 个样品的效价应相同。

2 结果

2.1 免疫兔血清效价测定结果 经3 次免疫后,对10 只免疫兔分别耳静脉采血,分离血清,按照1.2.3 的方法测定每只兔血清的凝集效价,结果见表1。

表1 免疫兔血清效价测定结果

2.2 混合血清效价测定结果 按照常量测定法10只兔子血清效价均高于1∶6 400,将10 份兔血清混合后,按照1.2.3 的方法测定混合血清的效价,同时用微量凝集法测定效价,结果见表2。

表2 混合血清效价测定结果

2.3 沙门菌马流产凝集试验阳性血清国家参考品候选物预配制及效价测定 对按1.2.4 预配置的3种效价的阳性血清国家参考品候选物进行效价测定,结果见表3。

表3 沙门菌马流产凝集试验阳性血清参考品候选物预试验样品效价测定结果

效价为1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 的沙门菌马流产凝集试验阳性血清参考品试剂测定效价为1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400,阴性对照血清与抗原不发生凝集反应,抗原与0.5%的苯酚生理盐水反应无自凝现象,试验成立,此时,试配制的效价为1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 的阳性血清国家参考品候选物测定效价为1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400,因此,可以按照试配比例配制相应效价的血清参考品。配制完成后用带16 号长针头的注射器等量分装血清,1.0 mL/支,按特定的冻干曲线冻干。

2.4 成品检验 效价为1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400的血清均为疏松物质,加入生理盐水后迅速溶解,按照现行《中国兽药典》附录进行无菌检验、剩余水分、真空度测定,无菌检验结果5/5 无菌生长,剩余水分测定结果均小于3%,真空度测定结果显示,冻干的血清均呈现白色、粉色或紫色辉光,均符合规定。效价测定结果显示,新制备的沙门菌马流产凝集试验阳性血清参考品与前一批次对应效价的血清参考品效价一致,结果见表4;均一性试验结果显示,每种效价随机抽取的3 支血清效价一致,且与对应效价的阳性血清参考品效价一致,结果见表5。

表4 沙门菌马流产凝集试验阳性血清参考品常量法效价测定结果

表5 沙门菌马流产凝集试验阳性血清参考品均一性试验常量法测定结果

3 讨论与结论

沙门菌马流产凝集试验是目前诊断马沙门菌病的主要实验室方法[5],病原分离鉴定也可以用于马沙门菌病的诊断,但不是在所有感染阶段均可以分离到细菌,LAMP 和PCR 等核酸检测方法也有研究[6],但因其影响因素较多,假阳性和假阴性结果不时出现,也未推广应用。沙门菌马流产凝集试验诊断抗原、阳性对照血清、阴性对照血清的质量直接关系到诊断结果的准确性,因此建立沙门菌马流产凝集试验阳性血清国家参考品对于抗原国家参考品、血清国家参考品的标定以及诊断抗原和对照血清的生产均具有十分重要的意义。

根据《中国兽药典》2015 年版标准物质保存期的规定,标准物质原则上不设保存期,沙门菌马流产凝集试验阳性血清的保存期为在2 ℃~8 ℃保存,有效期为96 个月。有研究结果显示,马流产沙门菌冻干阳性血清置于2 ℃~8 ℃保存13 年,其效价不降低,仍能达到《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定的质量标准,建议沙门菌马流产阳性冻干血清的保存期延长至10 年{4,7}。因此,该参考品置于2 ℃~8 ℃保存,至少可以保存10 年。

沙门菌马流产凝集试验目前用的方法是在小圆底试管中用2 mL 的体系进行试验,该方法的结果判定不清晰,新手操作很难确定凝集终点,不同人员对同一实验结果的判定差异大。本研究同时用2.0 mL 的体系和200 μL 的微量凝集体系进行平行试验,结果显示,微量凝集试验的结果均比传统试管凝集试验的结果敏感一个滴度,且微量凝集试验在微量反应板上进行,操作方便,省时省力,结果清晰,将来无论是马流产沙门菌实验室诊断还是沙门菌马流产凝集试验抗原参考品、血清参考品以及诊断抗原和对照血清的制备中均可以考虑用微量凝集法替代传统的常量法。