地榆对子宫内膜癌细胞凋亡及炎症因子表达的影响

刘维 杨誉佳 袁利

(遵义医学院附属医院妇科，贵州 遵义 563003)

子宫内膜癌是常见的妇科生殖系统恶性肿瘤之一，好发于更年期和绝经期妇女，其发病与生活方式密切相关，随着生活环境、生活习惯的改变，子宫内膜癌发病率正逐年上升〔1〕。对子宫内膜癌治疗方法早期以手术治疗为主，晚期以放疗、化疗为主，这些治疗方法对患者造成极大的伤害〔2〕。近年来，由于中药治疗、分子靶向治疗和激素治疗方法创伤小、效果佳，成为很多科研学者的研究热点〔3，4〕。地榆是一种常见的中药止血剂，具有止血、消炎、减少水肿、防止感染等作用，临床上地榆用于子宫肌瘤、宫颈癌等妇科疾病的治疗〔5〕。最近研究发现，地榆可使肝癌、胃癌、肺癌、宫颈癌等癌细胞在形态上发生皱缩、破裂、脱壁等变化，可不同程度地抑制癌细胞生长〔6〕。相关研究发现，子宫内膜癌的发生和发展与炎症密切相关，一些炎症因子、炎症细胞、趋化因子存在于子宫内膜癌细胞和局部组织中〔7，8〕。炎症可通过各种炎症细胞、炎症因子诱导炎症通路促进子宫内膜癌细胞的增殖和迁移，一些促炎细胞因子可抑制细胞凋亡，刺激更多的促炎细胞因子的产生，反馈性调节细胞增殖，抑制细胞凋亡〔9，10〕。因此，抑制炎症因子阻碍炎症通路可成为干预子宫内膜癌发生和发展的一种措施。本研究通过体外分离培养人子宫内膜癌细胞，探讨地榆对子宫内膜癌细胞凋亡和炎症因子表达的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 细胞来源：子宫内膜癌HEC-1-B细胞株(上海斯信生物科技有限公司)；药材：地榆提取液(西安金绿生物工程技术有限公司)。试剂：Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)(美国Sigma公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；噻唑蓝(MTT)试剂(广州朗日生物技术有限公司)；膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡试剂盒(江苏凯基生物公司)；白细胞介素(IL)-1β酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、IL-8 ELISA检测试剂盒、肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA检测试剂盒(上海晶天生物科技公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体、β-肌动蛋白(β-actin)抗体(美国Abcam公司)。

1.2子宫内膜癌细胞的培养 在无菌条件下取子宫内膜癌HEC-1-B细胞，培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃饱和湿度的CO2培养箱中培养，当细胞汇合度约为80%时，加入Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化传代，2～4 d传代一次，收集对数期生长的细胞，用于后续实验。

1.3子宫内膜癌细胞分组 对子宫内膜癌HEC-1-B细胞进行分组，用含有地榆提取液终浓度为0.00 mg/ml培养液培养的细胞为对照组。用含有地榆提取液终浓度为0.25、1.00、4.00 mg/ml培养液培养的细胞分别为低、中、高浓度组。

1.4MTT检测子宫内膜癌细胞生长抑制率 取子宫内膜癌细胞，接种到96孔细胞培养板中，按照对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组方法处理细胞，每组设6个复孔，培养48 h后，加入50 μl的0.5 mg/ml的MTT溶液到每孔细胞中，37℃孵育4 h，除去上清液后加入100 μl二甲基亚砜溶液，缓慢震荡反应10 min，待结晶物溶化后，在490 nm处检测各孔光密度(OD)值。以对照组测得A值为对照计算生长抑制率，细胞生长抑制率=1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。

1.5流式细胞术测定子宫内膜癌细胞凋亡 取各组细胞，培养48 h后收集细胞，用胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为106个/ml细胞，收集1 ml细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后，加入400 μl的结合缓冲液混合，再依次加入10 μl的PI和5 μl的Annexin V-FITC，放在室温下避光孵育5 min后，用流式细胞仪检测子宫内膜癌细胞凋亡情况。

1.6Western印迹测定Cleaved Caspase-3和Bax的表达水平 收集各组培养48 h后的细胞，预冷的PBS漂洗后加入50 μl细胞裂解液，置于冰上充分裂解30 min后，用细胞刮刀将细胞刮下，转移至EP管中，4℃，12 000 r/min离心10 min，吸取蛋白上清至另一EP管中，用BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白浓度。配制十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶，12%的分离胶和5%的浓缩胶。将蛋白样品与5×上样缓冲液按照4∶1的比例混合煮沸反应10 min，将煮沸过的混合液加入上样孔中，每孔加入30 μl的样品。用60 V电压电泳跑浓缩胶，待样品进入分离胶和浓缩胶边缘时，调整电压为120 V跑分离胶。将蛋白在300 mA恒流下条件下转印120 min至硝酸纤维素膜上。转膜结束后，放置在5%脱脂奶粉溶液中，室温孵育90 min，加入500倍稀释的一抗在4℃孵育过夜，用Tween-20 Tris-盐酸缓冲液(TBST)洗涤后加入1 000倍稀释的二抗在室温下孵育90 min，用TBST洗涤后，转移到暗室中，在凝胶成像系统中曝光，以β-actin为内参，分析Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表达水平。

1.7ELISA检测细胞培养液上清中IL-1β、IL-8、TNF-α含量 取各组子宫内膜癌细胞，培养48 h后，分别收集细胞培养液上清，用ELISA法分别检测上清液中IL-1β、IL-8、TNF-α含量，步骤按照试剂盒说明书进行操作，作标准曲线，纵坐标是标准品的吸光度值，横坐标是浓度，计算实验各孔检测指标的含量。

1.8统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析，组间LSD-t检验。

2 结 果

2.1地榆对子宫内膜癌细胞生长抑制的影响 与对照组 〔(0.00±0.00)%〕相比，低浓度组〔(8.41±0.65)%〕、中浓度组〔(35.83±3.56)%〕、高浓度组细胞抑制率〔(67.87±7.13)%〕均明显增加，中浓度组高于低浓度组，高浓度组高于中浓度组和低浓度组，差异具有统计学意义(P<0.05)。随着地榆浓度的增加抑制率逐步升高，具有浓度依赖关系。

2.2地榆对子宫内膜癌细胞凋亡的影响 与对照组〔(9.95±1.13)%〕相比，低浓度组、中浓度组、高浓度组的凋亡率〔(23.91±2.57)%、(39.42±4.48)%、(58.44±5.89)%〕显著升高，中浓度组高于低浓度组，高浓度组高于中浓度组和低浓度组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。这说明地榆可呈浓度依赖性地促进子宫内膜癌细胞凋亡。

图1 地榆作用48 h后各组细胞凋亡

2.3Western印迹测定细胞中Cleaved Caspase-3和Bax的表达 与对照组相比，低浓度组、中浓度组、高浓度组Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表达水平均有所上调，其中中浓度组Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表达水平上调幅度高于低浓度组，高浓度组Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表达水平上调幅度高于中、低浓度组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2和表1。这说明地榆可通过凋亡相关蛋白的上调促进子宫内膜癌细胞凋亡。

图2 Western印迹检测各组细胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平

表1 各组细胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平比较

与对照组比较：1)P<0.05；与低浓度组比较：2)P<0.05；与中浓度组比较：3)P<0.05；表2同

2.4地榆对子宫内膜癌细胞上清液中IL-1β、IL-8、TNF-α的影响 低浓度组、中浓度组、高浓度组细胞培养上清液中IL-1β、IL-8、TNF-α的含量均低于对照组，且随着地榆浓度的升高，细胞培养液上清中IL-1β、IL-8、TNF-α的含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。这提示地榆可以抑制子宫内膜癌细胞炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α的表达。

表2 各组细胞中IL-1β、IL-8、TNF-α含量

3 讨 论

随着生活水平的提高、科学技术的发展，人们的思想观念也逐步发生改变，从追求治愈到提高肿瘤患者的生存质量〔11〕。因此，寻找安全有效、副作用较小的治疗措施的研究备受关注，近年来利用中药预防子宫内膜癌成为研究的热点。一些中药可促进子宫内膜癌细胞的凋亡〔12〕。地榆是蔷薇科地榆属多年生草本植物的中草药，具有凉血止血、抗菌消炎、抗氧化、抗过敏等作用。目前已有研究报道地榆可通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡达到抗肿瘤的作用〔13〕。有报道证实，地榆皂苷类化合物可显著抑制甲状腺乳头癌细胞增殖、促进细胞凋亡，且呈剂量依赖性〔14〕。地榆可有效抑制人子宫颈癌细胞JTC-26、宫颈癌细胞Hela的生长〔5〕。本研究说明地榆可以抑制子宫内膜癌细胞生长，诱导细胞凋亡，具有抗癌作用，与上述报道类似。

促凋亡蛋白Bax是线粒体通路激活的关键分子，Bax参与细胞色素C从线粒体中释放，线粒体膜电位的改变及内质网钙离子浓度的调节，还可激活Caspase蛋白酶的级联反应，启动线粒体通路介导的细胞凋亡，最终导致细胞凋亡〔15〕。从雷公藤中提取的主要活性物质雷公藤甲素可抑制子宫内膜癌细胞的增殖，且呈现一定剂量依赖性，还可上调Caspase-3的表达，通过激活依赖Caspase的线粒体凋亡途径促进子宫内膜癌细胞的凋亡〔16〕；用不同浓度的紫草素作用于子宫内膜癌Ishikawa细胞，48 h后检测Bax和Bcl-2的表达量，发现随着紫草素浓度的增加Bax和Bcl-2的表达量也上升，紫草素通过上调Bax的表达，下调Bcl-2的表达，诱导子宫内膜癌细胞凋亡〔17〕；地榆类化合物作用于胃癌细胞，可调节细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达，激活Caspase-3通路促进细胞凋亡〔18〕。本实验证实了地榆可以通过调控Caspase和Bax的表达影响子宫内膜癌细胞凋亡。

在许多肿瘤细胞上清中可检测到炎症因子含量比正常细胞中高，研究认为，过量表达的炎症因子往往与肿瘤疾病的发生密切相关〔19，20〕。肿瘤的发生和发展与微环境中存在的炎症因子有关，各种炎症介质有利于肿瘤细胞的增殖和迁移，通过炎症信号通路抑制肿瘤细胞的凋亡〔21〕。流行病学数据显示，子宫内膜癌的危险因素之一是炎症因子的产生，炎症因子在子宫内膜癌细胞中分泌增多，检测子宫内膜癌中细胞IL-6蛋白表达上调，IL-6可通过调节细胞外调节蛋白激酶(ERK)-核因子(NF)-κB信号通路促进子宫内膜癌细胞增殖〔22〕。TNF-α可促进子宫内膜癌细胞的浸润生长，还可促进子宫内膜癌上皮细胞的增殖〔23〕。因此，通过抑制和干扰炎症因子的产生可为子宫内膜癌的治疗提供新的方向。本研究提示地榆可以减少子宫内膜癌炎症因子表达。

地榆促进子宫内膜癌细胞凋亡，抑制炎症因子的分泌，在子宫内膜癌发生和发展中发挥作用。炎症因子可能通过特定的信号通路促进子宫内膜癌的发展，因此，通过地榆抑制炎症形成过程中的炎症因子可为子宫内膜癌的治疗提供新的方向。