土壤重金属镉、铅及其复合污染对羊蹄(Rumex japonicus Houtt)生长及其抗性生理指标的影响

史雅甜,简敏菲,2,*,苗艳娇,贾蕊霞

1. 江西师范大学生命科学学院 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室，南昌 330022 2. 江西师范大学 鄱阳湖湿地与流域研究教育部重点实验室，南昌 330022

由于人类对矿产资源的开采活动日益频繁，导致重金属元素过量沉积而引起的土壤重金属污染问题也日益严重[1]。在不同重金属污染中，存在严重生物毒性的重金属离子有Pb2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+以及As3+等，其中Pb、Cd是土壤重金属污染中最严重、最普遍的重金属[2]，也是我国主要城市地表土壤超标最多的重金属[3]。

大量研究证实，重金属污染对植物的生长以及植物体内活性氧代谢系统的平衡有重要影响[4-5]。Pb2+、Cd2+等重金属污染对植物最直观的影响表现在生长迟缓、植株矮小等方面，并能影响植物组织内的抗氧化酶系统[6-7]，产生大量的氧自由基，活性氧会引起膜脂的过氧化作用，而丙二醛(malondialdehyde, MDA)为脂质氧化的终产物，是具有细胞毒性的物质，能在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶的活性，它的产生还能加剧膜的损伤[8]。因此，在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一个常用指标，其含量多少可以反映生物膜的危害程度[9]，了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。可溶性糖是植物体内一种重要的渗透调节物质[10]，不仅为植物的生长发育提供能量和代谢中间产物，而且具有信号功能，也是植物生长发育和基因表达的重要调节因子；在对植物进行调控时，它又与其他信号如植物激素组成复杂的信号网络体系[11]。MDA和可溶性糖含量的变化在一定程度上可以反映植物遭受逆境伤害的程度，是植物重要的抗性生理指标[12]。

杂草是一类环境适应性极强的植物，人们往往比较重视对杂草的防除，而忽视对杂草的综合利用[13]。如果能对杂草资源加以利用，充分发挥杂草植物在植物修复中的优势，对于重金属污染土壤的修复具有一定的现实意义[14]。羊蹄是广泛分布于我国华东、华中和华南等地区的一类杂草，属蓼科酸模属多年生草本植物，资源极其丰富，一般生于田边、路旁、河滩和沟边等湿地，在鄱阳湖各流域河岸带、滩涂地等有着广泛分布，尤其在鄱阳湖-乐安河段等区域以及受铜矿开采影响较严重的乐安河上游等区域的河岸滩地分布广泛且占据优势地位[15]。目前，对羊蹄的研究多集中在羊蹄的化学成份、药用成份和药理等方面[16-17]、羊蹄提取物在医药等方面的应用[18]、羊蹄在杀灭钉螺中的应用等[19]，但羊蹄作为一种具有广泛用途的乡土优势杂草在植物修复土壤重金属污染方面的研究较少。本研究以鄱阳湖-乐安河段河岸带生长的羊蹄幼苗为材料，通过盆栽控制实验，探讨重金属Pb、Cd对羊蹄生长的影响以及不同强度重金属污染胁迫下植物组织中MDA和可溶性糖含量的变化特性，一方面既可以为研究重金属对羊蹄的毒害机理及羊蹄对重金属的耐性机制提供一定的基础数据；另一方面也能为探讨开发乡土杂草植物修复土壤重金属污染的综合利用途径提供一定的借鉴。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试材料

供试植物活体为采自乐安河上游受铜矿开采影响较严重区域的河岸带优势物种羊蹄(R.japonicus)的幼苗，样本采集后及时带回实验室，盆栽前做适应性处理。

盆栽中供试基质为土壤与沙子混合物，均采自江西师范大学校园内，土壤与沙子按体积比例2：1充分混匀，准确称量一定量的混合基质装入口径22 cm、底直径16 cm、深16 cm的塑料花盆中备用，选取长势一致的羊蹄幼苗栽入盆中，栽种后适应性培养7 d。

1.2 试验设计

参考国家土壤环境质量标准(GB15618—1995)，盆栽土壤的重金属污染物胁迫控制条件分别为空白对照(CK)实验、单因素Pb2+的不同浓度胁迫条件、单因素Cd2+的不同浓度胁迫条件以及Cd+Pb双因素不同浓度复合污染胁迫条件等，不同因素重金属污染物分别设置5个浓度等级，共16个胁迫条件，控制实验浓度设置见表1。每个胁迫条件下分别重复5个盆栽样本，共栽种80盆。分别采用Pb(CH3COO)2·3H2O和CdCl2·2.5H2O配制不同浓度的Pb2+和Cd2+溶液，并按浓度要求添加溶液至预先准备的盆栽土壤中，并保证各组实验基质土壤中的重金属含量满足不同胁迫浓度要求，重金属被加入到实验基质后经人工充分混合，静置培养1～2周后移栽野外采集的羊蹄植株幼苗，每盆中移栽个体大小一致的羊蹄植株各3株，移栽处理后，根据每盘土壤水分状况，每隔1～2 d等量浇入自来水一次，共设置2个实验周期，分别为21 d与42 d。

1.3 生长指标的定量观测

分别选择21 d和42 d 2个实验周期测定各组羊蹄植株高度，用卷尺分别测量每株植物高度，并分别统计其平均值。选择42 d实验末期采收植物测试每组植物鲜重，不同处理各取3个样，吸干根部水分，称重后取平均值。

1.4 丙二醛与可溶性糖含量的测定

分别采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定可溶性糖含量和MDA含量[20]。分别在21 d和42 d的实验周期末，称取0.5 g羊蹄叶片，每个处理重复3次，将叶片剪碎，放入研钵中，加入1 mL 10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂，研磨成匀浆，再加4 mL TCA进一步研磨，将匀浆转移到离心管中，在转速4 000 r·min-1离心10 min；吸取上清液2 mL(空白管加2 mL蒸馏水)，加入2 mL 0.6% TBA溶液，混匀后在沸水浴上煮沸15 min，冷却后再离心1次；取上清液，用TU-1901紫外可见分光光度计分别在波长450 nm、532 nm和600 nm下测定消光度。按下列公式分别计算出MDA及可溶性糖含量。

C1=6.45(A532-A600)-0.56A450

(1)

C2=11.71A450

(2)

式中：C1为MDA的浓度(μmol·L-1)；C2为可溶性糖的浓度(μmol·L-1)；A450、A532和A600分别为波长450、532和600 nm(非特异吸收)处的消光度值。

根据上述浓度值及植物组织的鲜重(W)并按下列公式计算各样本组织中MDA及可溶性糖的含量值(μmol·g-1)：

w(MDA)=C1×V/W

(3)

w(可溶性糖)=C2×V/W

(4)

式中：C1、C2同上；w(MDA)为MDA含量(μmol·g-1)，w(可溶性糖)为可溶性糖含量(μmol·g-1)；V为植物组织提取液体积(L)；W为植物组织鲜重(g)。

1.4 数据处理

采用统计软件SPSS 20.0进行单因素方差分析(One-way, ANOVA)和最小显著性差异法(LSD)分析，对不同因素重金属胁迫下的各项指标数据进行差异性比较，Origin 9.0进行制图[21]。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 重金属Cd、Pb污染胁迫对羊蹄生长的影响

2.1.1 重金属Cd、Pb污染胁迫对羊蹄鲜重的影响

Pb、Cd作为有毒重金属，对羊蹄的生长发育会造成一定伤害。由图1可知，培养至42 d，无论是单因素Pb或Cd或双因素Cd+Pb的任何污染水平胁迫下，羊蹄的鲜重与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，且呈显著下降。分析表明，同一污染水平的单因素Cd与Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄鲜重的影响存在显著性差异(P<0.05)；但同一污染水平的单因素Pb与Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄鲜重的影响不存在显著性差异；而同一污染因素不同污染水平胁迫下，羊蹄的鲜重变化则均表现出显著差异性(P<0.05)。从图1可知，除单因素Pb浓度为100 mg·kg-1的胁迫条件外，其余单因素胁迫浓度条件下植株的鲜重均高于的Cd+Pb双因素复合污染胁迫下植株的鲜重，说明Cd+Pb双因素复合胁迫对鲜重的抑制影响要高于单因素胁迫。在单因素Pb胁迫下，羊蹄鲜重随其胁迫浓度的增加呈先升、后降、再升的“N”字形变化趋势。在Pb为100 mg·kg-1胁迫条件下，植株鲜重显著降低，仅为对照组(CK)的27.9%(P<0.05)；当Pb增加到200 mg·kg-1，鲜重升高；随着Pb胁迫浓度进一步增加，鲜重又显著减少(P<0.05)；当Pb为1 600 mg·kg-1，鲜重又升高，反映出低浓度(Pb 100 mg·kg-1)胁迫对鲜重的影响大于高浓度(Pb 1 600 mg·kg-1)胁迫的影响。

表1 单因素Pb、Cd或Cd+Pb复合污染处理的试验设计Table 1 Experimental design of single and combined stress of Cd and Pb

图1 单因素Pb、Cd或Cd+Pb复合污染对羊蹄鲜重的影响注：图中不同大写字母表示不同Pb污染处理组(单因素Pb污染 与Cd+Pb复合污染)之间呈显著性差异(P<0.05)； 不同小写字母表示不同Cd污染处理组(单因素Cd污染 与Cd+Pb复合污染)之间呈显著性差异(P<0.05)。Fig. 1 Effects of single or combined pollution of Pb and Cd on the fresh weight of R. japonicus Notes: Different capital letters indicate the significant difference at P<0.05 among various Pb treatments (single Pb pollution and Cd+Pb combined pollution); different lowercase letters indicate the significant difference at P<0.05 among various Cd treatments (single Cd pollution and Cd+Pb combined pollution).

2.1.2 重金属Cd、Pb污染胁迫对羊蹄株高的影响

重金属Pb、Cd对羊蹄生长发育的危害是多方面的，不仅体现在对植株鲜重的影响上，还表现在对植株株高的影响上。由图2可知，经历2个不同周期后，在任一污染因素、不同污染水平胁迫下，羊蹄株高的变化与CK组相比均存在显著性差异(P<0.05)，且均显著降低。分析表明，同一污染水平，单因素Pb与Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄株高的影响表现出不一致性。其中第1、第2与第4污染水平下，同浓度水平的单因素Pb与Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄株高的影响存在显著性差异(P<0.05)；而第3、第5污染水平下，同等污染水平的单因素Pb与Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄株高的影响不显著。同一污染水平下的单因素Cd与Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄株高的影响均存在显著性差异(P<0.05)，不同污染水平的单因素Cd对羊蹄株高的影响均存在显著性差异(P<0.05)；其余不同污染胁迫对羊蹄株高的影响规律表现不一致，例如，第1、第4污染水平的单因素Pb对羊蹄株高的影响差异不显著，其余不同水平的单因素Pb对羊蹄株高的影响存在显著性差异(P<0.05)；第2、第3污染水平的Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄株高的影响不显著，第4、第5污染水平的Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄株高的影响也不显著，而第1、第3、第5污染水平的Cd+Pb双因素复合污染对羊蹄株高的影响则存在显著性差异(P<0.05)。对图2的分析可知，随胁迫浓度增加及胁迫时间延长，除Pb为100 mg·kg-1以外，其余单因素胁迫条件下羊蹄植株的株高均显著(P<0.05)高于Cd+Pb双因素复合胁迫下的株高；在Cd+Pb双因素复合污染浓度Cd+Pb为(1 600+80) mg·kg-1的胁迫条件下，胁迫21d及42d后植株的株高分别仅为相应对照组的24.39%与30.70%(P<0.05)。这表明Cd+Pb复合胁迫对株高的危害要大于单因素胁迫，这与Cd+Pb双因素复合胁迫对羊蹄鲜重的影响规律基本一致。当单因素Pb浓度为100 mg·kg-1时，株高显著降低(P<0.05)，Pb为200 mg·kg-1的胁迫条件下株高升高后再随Pb浓度增加而下降，表明羊蹄对单因素Pb的胁迫反应更为敏感，在低浓度Pb胁迫下羊蹄的生理系统即有显著反应。

2.2 重金属Cd、Pb污染胁迫对羊蹄抗性生理指标的影响

2.2.1 重金属Cd、Pb污染胁迫对羊蹄MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化作用的最终产物，其含量是反映脂膜过氧化作用强弱和质膜受破坏程度的一个公认指标[22-23]。从图3可知，经历2个不同周期，除第1、第2水平的Cd+Pb双因素复合污染胁迫与第5水平的单因素Pb对羊蹄MDA含量的影响与CK组相比不存在显著性差异外，其余各污染水平下的单因素Cd、Pb或Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄MDA含量的影响与CK组相比均存在显著性差异(P<0.05)，且随各浓度增加而升高。分析表明，不同污染水平下，单因素Cd污染对羊蹄MDA含量的影响不显著，而单因素Pb污染对羊蹄MDA含量的影响则存在显著差异性(P<0.05)(仅第2与第3水平间不显著)，低水平的Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄MDA含量的影响不显著，高水平Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄MDA含量的影响存在显著性差异(P<0.05)；同一污染水平下，单因素Cd污染及Pb污染胁迫对MDA含量的影响均存在显著性差异(P<0.05)；而不同污染水平下的Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄MDA含量的影响规律不一致。由图3可知，同一胁迫周期下，单因素Cd污染胁迫下MDA含量的变化幅度不明显。胁迫42d时，Cd为80 mg·kg-1时MDA含量有所下降，表明羊蹄对一定浓度的单因素Cd污染胁迫具有自我生理调节能力。随着胁迫浓度升高，高浓度Cd+Pb双因素复合胁迫对细胞膜的破坏程度明显高于单因素胁迫。在Cd+Pb为(80+1 600) mg·kg-1的胁迫条件下，羊蹄植物组织中的MDA含量达最高值，胁迫21 d时，显著高于其对照组114.23% (P<0.01)，胁迫42 d时，显著高于其对照组116.75% (P<0.05)。在单因素Pb为100 mg·kg-1的胁迫条件下，羊蹄的MDA含量显著上升，胁迫21 d时，显著高于其对照组132.18% (P<0.05)；胁迫42 d时，显著高于其对照组31.31%(P<0.05)，随后下降后又有所上升，在Pb为1 600 mg·kg-1的胁迫条件下，MDA含量出现最低值，胁迫至42 d时，植株MDA含量仅为对照组的79.45%(P<0.05)，表明低浓度Pb胁迫对细胞膜的破坏大于高浓度的Pb胁迫。

图2 单因素Pb、Cd或Cd+Pb复合污染在不同周期对羊蹄株高的影响注：相同柱状图上方不同大写字母表示不同Pb浓度胁迫组(单因素Pb与Cd+Pb复合污染)之间呈显著性差异(P<0.05)； 相同柱状图上方不同小写字母表示不同Cd浓度胁迫组(单因素Cd与Cd+Pb复合污染)之间呈显著性差异(P<0.05)。Fig. 2 Effect of single or combined pollution of Pb and Cd on the heights of R. japonicus Notes: Different capital letters indicate the significant difference at P<0.05 among various Pb treatments (single Pb pollution and Cd+Pb combined pollution), while different lowercase letters indicate the significant difference at P<0.05 among various Cd treatments (single Cd pollution and Cd+Pb combined pollution).

图3 单因素Pb、Cd或Cd+Pb复合污染在不同周期对羊蹄丙二醛(MDA)含量的影响注：相同柱状图上方不同大写字母表示不同Pb浓度胁迫组(单因素Pb与Cd+Pb复合污染)之间呈显著性差异(P<0.05)； 相同柱状图上方不同小写字母表示不同Cd浓度胁迫组(单因素Cd与Cd+Pb复合污染)之间呈显著性差异(P<0.05)。Fig. 3 Effect of single or combined pollution of Pb and Cd on malondialdehyde (MDA) contents of R. japonicus Notes: Different capital letters indicate the significant difference at P<0.05 among various Pb treatments (single Pb pollution and Cd+Pb combined pollution), while different lowercase letters indicate the significant difference at P<0.05 among various Cd treatments (single Cd pollution and Cd+Pb combined pollution).

2.2.2 重金属Cd、Pb污染胁迫对羊蹄可溶性糖含量的影响

可溶性糖是植物体内一种重要的渗透调节物质，水分胁迫[24]、盐胁迫[25]和冷胁迫[26]等不良环境条件均会导致植物体内的可溶性糖含量发生显著变化。从图4可知，除21d周期内单因素Cd低水平污染对羊蹄可溶性糖含量的影响与CK组相比不显著外，其余各污染因素不同污染水平下对羊蹄可溶性糖含量的影响与CK组相比均存在显著性(P<0.05)差异。分析表明，同一污染水平下，不同污染因素对羊蹄可溶性糖含量的影响均存在显著性(P<0.05)差异；经历2个不同周期，不同污染水平的单因素Cd、Pb及Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄可溶性糖含量的影响均存在显著性(P<0.05)差异。另外，从图4还可看出，Cd+Pb双因素复合胁迫下可溶性糖含量的增长幅度均显著(P<0.05)高于单因素Cd胁迫处理组，说明Cd+Pb复合胁迫对可溶性糖的影响均显著(P<0.05)高于单因素Cd胁迫。低浓度Pb胁迫下，羊蹄体内可溶性糖含量增加；高浓度Pb胁迫下，羊蹄体内可溶性糖含量减少。

3 讨论(Discussion)

植物生物量、株高等生长指标的变化能综合反映重金属对植物的胁迫[27]，主要表现在植株生长迟缓、植株矮小等方面。本文重金属Cd、Pb的不同胁迫均导致羊蹄的株高和鲜重显著下降(P<0.05)。低浓度胁迫下，羊蹄的生长即受到显著抑制，且在相应的胁迫水平和处理时间上，Cd+Pb双因素复合胁迫的抑制作用高于单因素胁迫，这与王林和史衍玺[28]对辣椒的研究一致，但与孙约兵等[29]对三叶鬼针草和铁柏清等[30]对龙须草的研究结果不同，低浓度单因素Cd胁迫及Cd+Pb双因素复合胁迫对羊蹄的生长并未表现出“低促进高抑制”的趋势，可能是因为羊蹄为了保持细胞适应逆境的正常功能，需要消耗植物生长过程中的有效能量而导致羊蹄生长被抑制；低浓度重金属胁迫有利于植物对重金属的吸收，造成植物体内重金属离子在短时间内大量积累，使羊蹄生长受到抑制。低浓度Pb胁迫下，羊蹄在不同胁迫周期内的株高和鲜重降幅均显著大于其他胁迫浓度(P<0.05)，可能是因为突然的胁迫逆境引起植物生理的休克性反应[31]。在高浓度Pb胁迫下，植株高度最小，鲜重却达到Pb胁迫条件下的最大值，可能原因是随着单因素Pb胁迫浓度的升高，羊蹄茎的细胞伸长受到严重影响[32]，株高显著下降，但茎的分枝数目相对增加，可能是因为茎的伸长生长受阻后，侧芽得到更多发育。

图4 单因素Pb、Cd或Cd+Pb复合污染在不同周期对羊蹄可溶性糖的影响注：相同柱状图上方不同大写字母表示不同Pb浓度胁迫组(单因素Pb与Cd+Pb复合污染)之间呈显著性差异(P<0.05)； 相同柱状图上方不同小写字母表示不同Cd浓度胁迫组(单因素Cd与Cd+Pb复合污染)之间呈显著性差异(P<0.05)。Fig. 4 Effect of single or combined pollution of Pb and Cd on soluble sugar contents of R. japonicus Notes: Different capital letters indicate the significant difference at P<0.05 among various Pb treatments (single Pb pollution and Cd+Pb combined pollution), while different lowercase letters indicate the significant difference at P<0.05 among various Cd treatments (single Cd pollution and Cd+Pb combined pollution).

MDA是具有细胞毒性的物质，对质膜有毒害作用，主要破坏细胞膜系统。本研究高浓度Cd或Pb单因素胁迫后羊蹄的MDA含量呈下降趋势，可能是随着重金属Cd、Pb单因素胁迫浓度的增加，植物清除活性氧自由基的能力和修复氧伤害的能力被诱导后加强，从而表现出MDA含量下降。随着Cd+Pb双因素复合胁迫强度增加和胁迫时间的延长，MDA含量显著增加(P<0.05)，且在高浓度下MDA含量的增加幅度最大，这与相关研究的结果一致[33-34],即重金属离子浓度越高，MDA积累越多。可能原因是在Cd+Pb复合胁迫下，羊蹄叶片细胞内的活性氧增加，打破活性氧的代谢平衡，导致膜脂过氧化严重，膜结构遭到破坏，使细胞受伤，而且高浓度下Cd、Pb相互协作，加速对细胞膜的破坏[35]。

由于植物受重金属胁迫后也会导致体内碳水化合物代谢紊乱[36]，而可溶性糖是植物体内主要的碳水化合物，而植物体内可溶性糖的含量受可溶性糖的生成和分解共同影响。本文羊蹄受重金属胁迫培养至21 d后可溶性糖含量随单因素Cd及Cd+Pb双因素复合胁迫浓度的增加而上升，可能是受叶内不溶性糖降解以及光合产物运输受阻所致。培养至21 d，可溶性糖含量先上升后下降再上升，这与刺槐在干旱胁迫时可溶性糖含量的变化一致[37]，原因可能是可溶性糖合成较多、分解较少而导致可溶性糖积累；随着胁迫时间延长，羊蹄的呼吸逐渐加快，可溶性糖分解加速，从而导致胁迫中期可溶性糖减少；在胁迫后期，可溶性糖含量又迅速升高，也可能是因为严重胁迫导致呼吸速率降低所致。且随着胁迫时间延长，植物的自我调控能力减弱，导致可溶性糖减少。在单因素Pb胁迫下，随着胁迫强度的增加可溶性糖含量呈先增后降的趋势，与熊春晖等[38]关于莲藕对Pb、Cd的富集及其组织中可溶性糖变化的研究结果一致，这可能是因为重金属胁迫初期导致植物体内水分亏缺使叶片淀粉水解加强，光合产物输出减慢，导致糖类积累。随着胁迫进一步加强，水分亏缺加剧，光合作用减弱，光合产物减少，表现出的叶片可溶性糖的积累趋于减慢和停止。

综上所述：(1)Cd、Pb单因素或双因素复合胁迫对羊蹄的株高、鲜重等生长指标均产生显著性影响(P<0.05)，均显著低于不受胁迫的状态；Cd+Pb复合胁迫对羊蹄植株生长的危害均显著高于单因素Cd或Pb的胁迫。

(2)不同污染水平下，单因素Cd污染对羊蹄MDA含量的影响不显著，单因素Pb污染对羊蹄MDA含量的影响则存在显著差异性(P<0.05)；低水平的Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄MDA含量的影响不显著，高水平Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄MDA含量的影响存在显著性差异(P<0.05)。

(3)不同污染水平的单因素Cd、Pb及Cd+Pb双因素复合污染胁迫对羊蹄可溶性糖含量的影响均存在显著性(P<0.05)差异。Cd+Pb复合胁迫对可溶性糖的影响均显著(P<0.05)高于单因素Cd胁迫；低浓度Pb胁迫条件，羊蹄体内可溶性糖含量增加；高浓度Pb胁迫条件下，羊蹄体内可溶性糖含量减少。