水合欢对重金属Cd、Pb的耐受性及吸收富集特性

黑泽文，向慧敏,2,3,4，章家恩,2,3,4,*，梁开明，郅帅杰，赵敏

1. 华南农业大学资源环境学院，广州 510642 2. 农业部华南热带农业环境重点实验室，广州 510642 3. 广东省现代生态农业与循环农业工程技术研究中心，广州 510642 4. 广东省生态循环农业重点实验室，广州 510642 5. 广东省农业科学院水稻研究所，广州 510640

随着经济的迅速发展，工矿业和交通运输业等活动愈加频繁，化肥农药的使用也越来越多，导致土壤重金属污染不断加重，并日益成为当前全球性环境问题之一[1-2]。重金属污染不仅会对生态环境造成危害，也会影响作物对土壤养分的吸收，威胁农作物的生长，同时，还会通过食物链危害人体健康[3-4]。目前，农田重金属污染问题已受到社会的广泛关注，在我国，稻田已经受到不同程度的重金属污染[5]。其中利用物理、化学方法修复土壤重金属污染不仅成本高，而且可能对土壤中的微生物群落产生危害，造成二次污染，而选用植物修复手段不仅成本低，且不会对土壤造成二次污染，是一种环境友好型修复方式[6]。因此，寻找对稻田土壤重金属污染修复的方法成为当前热点问题之一。目前，已经发现的Cd超富集植物有伴矿景天、黄蜀葵和万寿菊等，Pb超富集植物有槐叶萍和天蓝遏蓝菜等[7-11]。当超富集植物暴露在污染环境中时，植物体内的丙二醛含量降低，但抗氧化酶活性升高[12-13]。因此，筛选对农田土壤重金属进行提取或修复的植物，并研究其在重金属污染下的生理生态变化及相关修复效果有重要意义。

目前，国内外已发现的超富集植物有700多种，广泛分布于50个科，主要集中在十字花科[14]。对于豆科植物而言，虽然大多数植物没有达到超富集植物的标准，但部分与豆科植物共生的根瘤菌由于具有耐受重金属、改变根际土壤重金属形态的特性，因此，可以采用豆科植物-根瘤菌共生体系来修复重金属污染土壤[15]。目前，我国发现的可以对重金属污染土壤修复的豆科植物主要集中在生物量大的木本豆科植物，如刺槐、银合欢和胡枝子等，修复的地点主要集中在重金属尾矿废弃地[16-18]，而采用豆科植物修复重金属污染农田土壤的研究较少，尤其是采用水生豆科植物修复水田重金属污染的研究鲜有报道。

水合欢(Neptuniaolerace)是一种豆科水生蔬菜，又称水含羞草(water mimosa)，其在稻田生态系统中与水稻间作时可以提高水稻产量和土壤全氮含量[19]。已有研究表明，水合欢在水培条件下对重金属具有一定的耐性，可以吸收部分重金属[20]。为此，本研究通过盆栽实验，探究水合欢在土培条件下对稻田2种最常见的重金属Cd、Pb污染的耐受能力和吸收富集效果，旨在探索水合欢在重金属胁迫条件下的抗逆特性及其对重金属的富集特性，并为寻找能够修复稻田土壤重金属污染的新植物提供参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试植物材料

供试的水合欢材料购于广西水生蔬菜公司，选取生长状况良好的水合欢植株，采取扦插方法移栽水合欢苗，并种植于华南农业大学校内生态农场中，每株水合欢移栽时长度为15 cm。

1.2 实验设计

用于栽培水合欢的土壤取自华南农业大学校内农场的水稻田，经风干、碾碎和过5 mm筛后，每桶取4 kg土壤装于聚乙烯黑色塑料桶内，桶顶部外直径31.50 cm、内直径29.50 cm，底部外直径20.70 cm、内直径19.70 cm，高21.50 cm。分别精确溶解一定量的重金属CdCl2·2.5H2O(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、Pb(NO3)2(分析纯，广东汕头市西陇化工厂)加入土壤搅拌混匀后静置14 d。加入重金属Cd后，土壤Cd浓度分别为0、50、100、180 mg·kg-1；加入重金属Pb后，土壤Pb浓度分别为0、500、1 000、1 800 mg·kg-1，以上每个处理设5个重复。2017年6月27日将水合欢移栽于含有重金属土壤的塑料桶中，于2017年8月3日将水合欢整株收获，种植时间持续37 d。

供试土壤的全镉和全铅含量为0.19 mg·kg-1和48.56 mg·kg-1，供试土壤的pH、有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、有效磷和有效钾的含量分别为23.60 g·kg-1、1.33 g·kg-1、1.39 g·kg-1、19.5 g·kg-1、465.14 mg·kg-1、17.80 mg·kg-1和286.38 mg·kg-1。

1.3 取样及分析方法

每隔10 d测定一次水合欢植株长度，以水合欢从土表面至水合欢最长分枝顶端为准。水合欢收获时将整株放入冰盒中带回实验室，其中一部分鲜样保存于-40 ℃冰箱中待测酶活性，另一部分样品用自来水冲洗干净后，再用去离子水冲洗3次，最后于105 ℃烘干2 h杀青，65 ℃烘干至恒重，烘干后粉碎用于测定植物重金属含量。待水合欢收获后，取花盆中水合欢根周围的土壤，在阴凉通风处风干，过100目筛后保存，用于测定土壤样品中的重金属含量。

将水合欢分为根、茎和叶3个部位，采用考马斯亮蓝法测定这3个部位中可溶性蛋白含量，采用愈创木酚法测定过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性，采用NBT光化还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性。利用丙酮提取水合欢叶片中的叶绿素，用硫代巴比妥酸法测定根、茎和叶样品中丙二醛(MDA)含量[21]。测定植物和土壤样品中的重金属含量时，准确称取0.1 g样品，加入少量去离子水将样品浸湿，再加入5∶1(V∶V)浓硝酸与高氯酸12 mL，盖上弯曲漏斗放置过夜，在电热板上加热微沸(约150 ℃)，如样品为棕色，加入微量浓硝酸加热，直至冒白烟近干时，冷却，用5 mL去离子水洗涤漏斗，继续加热，将酸挥发干，用少量去离子水转入250 mL容量瓶中并定容，最后将样品转移至25 mL塑料瓶中，用原子吸收石墨炉测定重金属含量[22]。土壤基本理化性质的测定方法参照土壤农业化学分析方法[23]。

水合欢对Cd和Pb的累积特征采用富集系数和转运系数来表示：

富集系数=植物体内重金属含量/土壤中重金属含量

转运系数=地上部重金属含量/地下部重金属含量

1.4 数据统计分析

实验数据使用Excel 2010和SPSS 17.0进行统计分析，采用单因素方差分析(One Way ANOVA)中的duncan检验进行显著性差异分析，显著性差异水平设置为P<0.05。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 Cd、Pb胁迫对植株长度、生物量和叶绿素含量的影响

在水合欢移栽15、25和35 d时，不同浓度Cd胁迫处理下，水合欢的植株长度与对照组差异显著(P<0.05)。移栽15 d时，50、100和180 mg·kg-1Cd胁迫下，水合欢的植株长度分别比对照降低了12.1%、27.1%和34.6%；移栽25 d时，50、100和180 mg·kg-1Cd胁迫处理下，水合欢的植株长度分别比对照降低了17.1%、36.4%和46.7%；移栽35 d时，50、100和180 mg·kg-1Cd胁迫处理下，水合欢的植株长度分别比对照降低了8.7%、30.6%和34.6%，可见Cd胁迫对水合欢的植株长度有显著的抑制作用。然而，在不同浓度Pb胁迫处理下，水合欢的植株长度在移栽15、25和35 d时均未表现出与对照组的显著性差异(图1)。

不同浓度Cd处理下，水合欢根、茎和叶生物量均与对照差异显著(P<0.05)。其中，不同浓度Cd胁迫处理使根的生物量降低了25.7%～47.0%，茎的生物量降低了34.6%～71.3%，叶生物量降低了21.8%～64.8%，可见不同浓度Cd胁迫处理对水合欢的生物量具有显著的抑制作用。在Pb胁迫下，不同浓度处理中水合欢的各组织生物量与对照均未表现出显著性差异(图2)。

不同浓度的Cd、Pb胁迫处理对水合欢叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素a+b含量均无显著影响(图3)。

2.2 Cd、Pb胁迫对可溶性蛋白含量、抗氧化性酶活性和丙二醛含量的影响

在Cd胁迫处理下，水合欢根、茎和叶各组织的可溶性蛋白含量与对照无显著差异(图4)。但根中CAT活性随着Cd浓度的增大，先降低后升高。在50 mg·kg-1Cd处理下，根中CAT活性受到胁迫比对照降低30.6%，Cd浓度升高至180 mg·kg-1时，根中CAT活性显著高于对照36.8%(P<0.05)，此时水合欢CAT对重金属Cd的抗性达到最高。然而根中的POD与SOD活性与对照均无显著差异；茎中SOD活性随着Cd浓度的增大，也是先降低后升高，在50 mg·kg-1Cd处理下，SOD活性受到胁迫比对照降低42.3%，Cd浓度升高至180 mg·kg-1时，SOD活性升高至与对照相同的水平，但茎中的CAT与POD活性与对照均无显著差异。不同浓度Cd处理下，叶中SOD活性与对照未见显著差异。在100 mg·kg-1Cd处理下，叶中POD活性与对照比升高47.3%，而CAT活性与对照无显著差异，180 mg·kg-1Cd处理下，CAT与对照比升高209.3%，而POD活性与对照无显著差异(图5～图7)。

图1 Cd、Pb对水合欢植株长度的影响注：图中不同小写字母表示水合欢在不同浓度重金属处理下差异显著。下同。Fig. 1 Effect of Cd and Pb on the plant length of Neptunia olerace Note: Different lowercase letters mean significant differences between different heavy metal concentration groups. The same below.

图2 Cd、Pb对水合欢不同组织生物量的影响Fig. 2 Effect of Cd and Pb on the biomass in different tissues of Neptunia olerace

图3 Cd、Pb对水合欢叶绿素含量的影响Fig. 3 Effect of Cd and Pb on the chlorophyll content of Neptunia olerace

图4 Cd、Pb对水合欢不同组织可溶性蛋白含量的影响Fig. 4 Effect of Cd and Pb on the content of soluble protein in different tissues of Neptunia olerace

在Pb胁迫处理下，水合欢根、茎和叶各组织的可溶性蛋白含量与对照相比未达到显著差异(图4)。不同浓度的Pb胁迫使根中CAT活性比对照显著降低33.9%～43.9%(P<0.05)；根中SOD活性随着Pb浓度增大，先降低后升高。在500 mg·kg-1Pb处理下，根中SOD活性受到胁迫比对照降低3.3%；当Pb浓度升高至1 800 mg·kg-1时，SOD活性与对照无显著差异。根和茎中POD活性在各处理间不存在显著差异。在500 mg·kg-1Pb处理下，茎中CAT受到胁迫活性比对照降低29.0%；在1 800 mg·kg-1Pb处理下，CAT受到胁迫活性比对照降低19.5%。在1 000 mg·kg-1Pb处理下，茎中SOD活性受到胁迫比对照降低51.47%。随着Pb浓度的升高，叶中CAT活性比对照显著升高55.9%～85.41%(P<0.05)，叶中POD活性先降低后升高，在500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1的Pb处理下，POD活性受胁迫比对照降低38.6%～41.9%，在Pb浓度为1 800 mg·kg-1时，POD活性与对照无显著差异(图5～图7)。

图5 Cd、Pb对水合欢不同组织CAT活性的影响Fig. 5 Effect of Cd and Pb on the activity of CAT in different tissues of Neptunia olerace

图6 Cd、Pb对水合欢不同组织POD活性的影响Fig. 6 Effect of Cd and Pb on the activity of POD in different tissues of Neptunia olerace

图7 Cd、Pb对水合欢不同组织SOD活性的影响Fig. 7 Effect of Cd and Pb on the activity of SOD in different tissues of Neptunia olerace

图8 Cd、Pb对水合欢不同组织MDA含量的影响Fig. 8 Effect of Cd and Pb on the MDA content of different tissues of Neptunia olerace

在Cd胁迫处理下，不同浓度Cd处理对水合欢根和茎中的MDA含量无显著影响，但水合欢叶片中的MDA含量先降低后升高，在100 mg·kg-1Cd处理下，水合欢叶片MDA含量比对照显著降低22.23%。不同浓度Pb处理对水合欢不同组织中的MDA含量无显著影响(图8)。

2.3 水合欢对重金属的富集系数和转运系数

水合欢对2种重金属的吸收和转运富集情况不同。在Cd胁迫处理下，水合欢根周围的土壤、根、茎和叶中的Cd含量随着处理浓度的升高而显著升高(P<0.05)，根部含量为土壤浓度的3.40～5.53倍，根部对Cd有很强的吸附与富集能力，水合欢地上部的Cd含量远小于地下部，并呈现根>叶>茎的趋势，但在不同浓度Cd胁迫处理下，水合欢对Cd的富集系数仅为0.28～0.32，转运系数为0.05～0.08(表1)，说明水合欢对Cd的吸收未达到超富集植物的标准。

在Pb胁迫处理下，水合欢根周围的土壤、根、茎和叶的Pb含量随着处理浓度的升高而显著升高(P<0.05)，植物各部分中的Pb含量呈现如下变化趋势：根>叶>茎，且不同浓度Pb胁迫处理下水合欢对Pb的富集系数仅为0.02～0.04，转运系数为0.04～0.08(表1)，说明水合欢对土壤Pb的吸收也未达到超富集植物的标准。

3 讨论(Discussion)

在重金属胁迫条件下，植物最直观的响应是株高和生物量的变化，植物受到的伤害越大，生长越慢、株高越低、生物量越小[24]。本研究结果表明，在Cd胁迫处理下，水合欢的植株长度和生物量随着重金属处理浓度的升高而降低。吕金印等[25]研究了重金属Cd对5种叶菜的影响，发现随着Cd浓度的升高，5种叶菜的生物量显著降低，重金属胁迫会导致植株代谢紊乱，造成植株矮化、叶片萎焉，最终使生物量下降，这与本研究结果一致。但在Pb胁迫处理下，水合欢的生物量并未随Pb浓度升高而变化，在1 800 mg·kg-1Pb处理下，水合欢植株长度和生物量均未受影响，说明水合欢对Cd的耐受性较差，而对Pb的耐受能力较强。

叶绿素在光合作用中起着捕获光的作用，是植物代谢的重要物质。湛灵芝等[26]在研究Cd对少根紫萍的影响时，发现Cd抑制了植物叶绿素酸酯还原酶的合成，进而导致植株体内叶绿素含量的降低。龚小敏等[27]在研究Cd对苎麻根系及叶片抗氧化酶系统的影响时发现，苎麻在遇到不良环境时根系产生较多的可溶性糖和游离性脯氨酸，以防止叶片停止光合作用而导致植株死亡。本研究中，随着Cd和Pb浓度的升高，水合欢叶片叶绿素含量没有发生变化，可能是由于水合欢在重金属胁迫下，其根系迅速调节、富集，减缓了重金属向地上部的迁移，进而维持了叶绿素含量并保证了叶片的正常光合作用，最终防止植株的死亡[20,28]。

表1 水合欢对土壤Cd、Pb的吸收与转移Table 1 The accumulation and transportation of soil Cd and Pb to Neptunia olerace

在Cd和Pb胁迫处理下，水合欢的不同组织中CAT、POD和SOD活性均有不同表现。对CAT而言，水合欢叶片中的CAT活性均随Cd、Pb胁迫浓度的升高而升高。对POD而言，水合欢的根和茎在各处理下POD活性没有显著差异，而叶片中的POD活性与对照出现显著差异。陈海林[35]在对水葫芦的研究中发现，水葫芦根的CAT活性下降，但叶片中的酶活性上升，原因可能是水葫芦根的抗氧化酶系统首先遭到破坏而迅速下降，而只有少部分的重金属转移到叶片中，故导致叶片中CAT活性上升。本研究结果也具有类似的变化规律，即重金属Cd与Pb首先破坏根与茎的POD酶系统，而叶片中的POD酶受到重金属的胁迫相对较弱，故叶片中POD活性较高。对SOD而言，Cd与Pb胁迫对叶片中SOD活性均未产生影响，说明叶片中SOD酶系统尚未受到重金属的毒害和破坏。

在重金属胁迫下，当细胞受到活性氧伤害时，植物的膜系统发生过氧化，产生MDA[39]。刘玥和郭文强[40]在研究Cd与Pb对中华结缕草和皱叶酸模的影响时发现，随着重金属浓度升高，植物体内的MDA含量升高，植株受到的伤害增大。本研究发现在Cd与Pb胁迫下的水合欢的根和茎中，MDA含量无显著变化。这说明现有浓度的重金属Pb处理尚未破坏和伤害水合欢存活部位的膜系统，Cd处理已经破坏了水合欢叶片的膜系统，水合欢对Pb的耐受性较强，而对Cd的耐受性较弱。

水合欢对2种重金属的吸收主要集中在根部，茎和叶片中的重金属含量很低，2种重金属在水合欢体内的含量表现为：根>叶>茎，可能是由于豆科植物的根和根瘤可以分泌有机酸螯合土壤中的重金属，当重金属进入水合欢后，大部分重金属被凯氏带所阻挡，不能运输至地上部，只有很小一部分重金属被运输至水合欢的地上部[30,39]。这也是水合欢未能达到超富集植物标准的重要原因。然而，在对重金属污染土壤进行修复的过程中，植物根系通过积累、螯合、氧化还原等作用可将土壤中的重金属固定，减少重金属在地下和地表的渗透和淋溶，减少对土壤和周围环境的危害[41]。在本研究中，Cd胁迫处理下水合欢根部的重金属含量高于土壤中的重金属含量，且根部重金属含量远大于地上部重金属的含量。Pb胁迫处理下水合欢根部重金属含量也远大于其地上部重金属的含量。Vázquez等[42]在利用白羽扇豆对As和Cd重金属污染土壤进行修复的过程中，也发现大量的As和Cd被固定在白羽扇豆的地下部，与本研究结果类似。谷金锋[43]在对重金属尾矿库的优势植物根周土壤与天然林土壤中重金属含量对比分析的过程中发现，部分植物根周土壤重金属含量显著高于天然林土壤，对土壤中重金属的去除具有良好的效果。本研究结果与谷金锋的研究结果相似，本实验所取土壤为根周土壤，土壤中的重金属含量均高于初始浓度，可能原因是水合欢根部通过吸收、螯合、络合和沉淀等作用将土壤中的重金属富集[14]，使根周土壤重金属的含量远大于实验初始时土壤中的重金属浓度。

综上可见，水合欢受到Cd污染胁迫时，生物量和植株长度降低，体内CAT、POD和SOD活性升高，但仍可维持存活叶片中的叶绿素含量、生长部分的可溶性蛋白含量以及根和茎细胞的膜脂过氧化程度无显著变化，而叶片细胞的膜脂过氧化程度降低，表明水合欢对Cd污染胁迫耐受性较低。水合欢受到Pb污染胁迫时，水合欢生物量、植株长度、叶片叶绿素含量、生长部分可溶性蛋白含量以及膜脂过氧化程度均未发生改变，但体内的CAT、POD和SOD活性升高，表明水合欢对Pb污染胁迫耐受性较高。虽然水合欢对Cd、Pb这2种重金属未达到超富集植物的标准，但水合欢的地下部根系中的重金属含量远高于地上部重金属含量。基于其根系对土壤重金属具有一定的富集作用，加上水合欢为直根系植物，根系较浅，便于回收，而且可以固氮，茎长，生物量大，可在茎的多个部位生根[44-46]。因此，可考虑利用水合欢与水稻等水生作物进行间套作，以原位缓解土壤重金属污染对粮食等农产品生产所带来的安全风险。