高效液相色谱法测定双醋瑞因胶囊的有关物质

杨文凤，石 颖，张慧文

（广东省广州市药品检验所，广东 广州 510160）

双醋瑞因（C19H12O8）属蒽醌类药物，化学名为4，5-二乙酰氧基 -9，10-二氢 -9，10-二氧代 -2蒽羧酸，主要活性代谢产物为大黄酸[1]，是骨关节炎发病机制中参与重要炎性反应的白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子-α的抑制剂[2-4]，具有抗炎、镇痛作用，抑制软骨降解及破骨细胞性骨破坏[5-8]的作用，用于治疗退行性关节疾病（骨关节炎及相关疾病），可显著改善骨关节炎及相关疾病引起的疼痛和关节功能障碍等。为提高检验效率，参照进口药品注册标准，本试验中采用高效液相色谱（HPLC）法测定双醋瑞因胶囊有关物质[9-12]，修订系统适用性试验要求[13-16]，结果各杂质出峰顺序不因色谱柱及流动相比例的改变而改变，且杂质峰易分离，便于辨识。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters E2695型高效液相色谱仪，含Empower工作站、Waters 2489型紫外检测器(美国 Waters公司）；MT-5型电子天平(百万分之一)、XS105 DualRange型电子天平(十万分之一)，均购于瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 试药

样品：双醋瑞因胶囊(某企业，批号分别为 A，B，C)；峰识别对照品（某企业，批号为 371111，含量为100.5%，含双醋瑞因、单乙酰大黄酸Ⅰ、单乙酰大黄酸Ⅱ和大黄酸）；大黄酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为 110757-200206，含量为 100.00%）；醋酸（分析纯）；二甲基甲酰胺（DMF，99.8%，Merck 公司，色谱纯）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

供试品溶液：避光操作，取装量差异项下粉末，研细，取细粉适量（约相当于双醋瑞因50 mg），精密称定，置50 mL容量瓶中，加DMF 40 mL，超声5 min，振摇使双醋瑞因溶解，加DMF稀释至刻度，摇匀，立即精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，用流动相乙腈-甲醇-醋酸溶液（20∶45∶35，V／V／V）稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得（临用新制）。

对照品溶液：取大黄酸对照品约10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加DMF 10 mL溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

对照溶液与灵敏度试验溶液：避光操作，精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；精密量取对照溶液1 mL，置20 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度试验溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：醋酸溶液（取水1 000 mL，用醋酸调pH至2.5)-甲醇 -乙腈(35∶45∶20，V／V／V）；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL ／min；柱温：30 ℃ ；进样量：20 μL。理论板数按双醋瑞因峰计应不低于2 000。

取峰识别对照品适量，加DMF溶解并稀释成每1 mL约含1 mg的溶液，精密量取，加流动相稀释成每1 mL含 10 μg的溶液，量取20 μL，注入液相色谱仪，精密量取灵敏度试验溶液20 μL，注入液相色谱仪，双醋瑞因峰的信噪比大于10。再精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪测定，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。各组分的出峰顺序为双醋瑞因、单乙酰大黄酸Ⅰ、单乙酰大黄酸Ⅱ和大黄酸，相对保留时间分别为 1.0，1.4，1.8，2.2 min（图 1）。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图

2.3 专属性试验

取样品粉末适量（相当于含双醋瑞因125 mg），精密称定，置50 mL容量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为未破坏样品贮备液。精密移取未破坏样品贮备液2.0 mL共4份，分别置10 mL容量瓶中，分别进行如下处理：加1 mol／L盐酸溶液2.0 mL，室温下放置 5 h后，加入 1 mol／L的氢氧化钠溶液适量，使之成中性，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤(酸破坏)；加 1 mol／L 氢氧化钠溶液 2.0 mL，室温下放置30 min后，加入1 mol／L的盐酸溶液适量，使之成中性，加流动相稀释至刻度(碱破坏)；加30%过氧化氢溶液2.0 mL，室温下放置5 h后，加流动相稀释至刻度(氧化破坏)；放于光照强度为4 500 lx的实验箱中，室温下放置24h后，加流动相稀释至刻度(光照破坏)。另外，取双醋瑞因胶囊内容物（约相当于双醋瑞因125 mg），精密称定，放于密封的耐高温玻璃小瓶中，置80℃高温6 h，取出，放冷，转移至50 mL容量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀(高温破坏)。精密量取上述条件处理溶液5 mL，分别置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。详见图2。

图2 专属性试验高效液相色谱图

可见，酸、碱、氧化、光照、高温破坏条件下降解产生的杂质峰不干扰主成分峰，主成分峰均一，色谱峰纯度大于990，峰纯度符合要求，无杂质峰与主成分一起洗脱。结果表明，双醋瑞因在光照、碱性条件下降解较明显，酸、高温、氧化条件下较稳定。样品记录色谱图至3倍主峰保留时间后无超过0.05%限度的降解杂质峰出现，在进行有关物质检查时样品记录色谱图至3倍主峰保留时间是合适的。同时也表明，本方法可稳定地检测样品所发生的降解变化，方法专属性强。

2.4 方法学考察

线性关系考察：取大黄酸对照品10.104 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加入DMF 10 mL使溶解，加入流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为大黄酸线性考察溶液（2.02 μg ／mL）；分别量取该溶液适量，置适宜容量瓶中，加流动相稀释成质量浓度分别为 1.20，1.00，0.60，0.20，0.08，0.04 μg ／mL 的系列线性考察溶液。按拟订色谱条件测定，以质量浓度（C）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 A＝83 963 C-787.71，r＝0.999 9（n＝7）。结果表明，大黄酸质量浓度在 0.04 ～2.02 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。取双醋瑞因胶囊内容物0.262 6 g（平均装量每粒 0.246 31 g，含双醋瑞因 50 mg），精密称定，置50 mL容量瓶中，加DMF至刻度，摇匀；精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度；再取1 mL，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为自身对照线性考察溶液（双醋瑞因质量浓度为 2.13 μg／mL），分别取该溶液适量，置容量瓶中，加流动相稀释制成质量浓度分别为 1.07，0.64，0.53，0.32，0.11，0.04，0.02 μg／mL的自身对照系列线性考察溶液。按拟订色谱条件测定，以质量浓度（C）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 A＝6 110 430 C＋342.29，r＝1.000 0（n ＝8）。结果表明，双醋瑞因质量浓度在 0.02～2.13 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取同一大黄酸对照品溶液，每次进样20 μL，重复进样6次，记录色谱图。结果的 RSD为 0.21%（n＝6），表明仪器精密度良好。

检出限（LOD）和定量限（LOQ）确定：经试验，双醋瑞因及大黄酸的最低 LOD（S／N ＝3）分别为 0.006 μg／mL和 0.017 μg／mL，LOQ（S ／N ＝ 10）分别为 0.02 μg／mL和 0.058 μg ／mL。

稳定性试验：取同一供试品溶液（批号C），分别于配置后的 0，2.5，6，17，19，33 h 时进样分析。结果随着时间的延长，主成分峰峰面积变化不明显，但单乙酰大黄酸Ⅰ和单乙酰大黄酸Ⅱ随着时间的延长峰面积逐渐增加，在33 h时含量分别由0.08%增加至0.16%、由0.05%增加至0.10%，但未见其他杂质峰增加，表明双醋瑞因在DMF中稳定性较差，应临用现配，立即用流动相稀释。

加样回收试验：取大黄酸对照品约5 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加DMF溶解并定容至刻度，摇匀，作为贮备溶液。精密量取该贮备溶液1，2，3 mL（比例为50%，100%，150%），置加入相应空白辅料的100 mL容量瓶中，每个浓度样品溶液各制备3份，分别进样，记录峰面积，按外标法计算大黄酸含量，并计算回收率。结果见表1。

表1 大黄酸回收试验结果（n＝9）

2.5 样品含量测定

按拟订色谱条件，对3批样品进行有关物质检查，用自身对照法计算各有关物质含量。结果见表2。

表2 3批样品有关物质检查结果(%)

3 讨论

分别考察了3个不同厂家品牌的色谱柱Kromasil C18柱 （250 mm ×4.6 mm，5 μm），Agilent HC-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），GL ODS-3 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），主峰与已知杂质分离度均大于 1.5，按双醋瑞因峰计理论板数均大于3 000，表明本试验中选定的色谱条件下，各组分峰形分离较好，适用于不同品牌C18柱，耐用性较好，满足检验需求。

在“药典在线”网上参照2010年版《印度药典》，采用与本方法相同的Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为 0.2%磷酸溶液 -乙腈（62∶38，V／V），检测波长为 254 nm，流速为 1.0 mL／min，柱温为 30℃，进样量为20 μL，测得单乙酰大黄酸Ⅰ、单乙酰大黄酸Ⅱ、大黄酸的分离度分别为 2.273，2.383，1.151，分离度较高，结果与本方法基本一致。

为考察色谱条件的微小变化对各有关物质测定结果的影响程度，本试验考察了流动相比例（醋酸水溶液 -甲醇 -乙腈 (30 ∶47.5 ∶22.5，V／V／V)即水相30% ，以及醋酸水溶液 -甲醇 -乙腈(40 ∶42.5 ∶17.5，V／V／V)即水相 40% 及 pH（±0.2)即 pH 2.3 及 pH 2.7的变化对测定结果的影响，有关物质测定结果差异不大（RSD＜2.0%），均未检出其他最大单个未知杂质峰，表明本试验中选定的色谱条件下，各组分峰形分离较好。

本研究中色谱条件采用醋酸溶液（取水1 000 mL，用醋酸调节 pH 至 2.5）-甲醇 -乙腈（35∶45 ∶20，V／V／V）为流动相，各杂质的出峰顺序不易因色谱柱及流动相比例的改变而改变，在使用不同品牌C18柱时无差异，因此适用的色谱柱范围较广，避免因所用色谱柱柱效下降、分离度变差、已知杂质可能发生色谱峰重叠、未知杂质可能被误认为已知杂质而导致杂质误判的情况。同时，修订系统适用性试验要求，用含双醋瑞因、单乙酰大黄酸Ⅰ、单乙酰大黄酸Ⅱ和大黄酸的峰识别对照品为参比物，以相对保留时间作为系统适用性的要求和峰识别依据，方法更清晰、明了；由于该系统条件运行一针的时间短，能有效提高检验效率。

综上所述，本试验中建立的系统条件适用于双醋瑞因胶囊有关物质的测定，适用的色谱柱范围较广，各杂质峰易分离，试验效率高，结果准确可靠。