心脉通软胶囊的质量控制及稳定性考察

郑 林，刘丽娜，李月婷，李勇军，黄 勇，王永林，兰燕宇

（贵州医科大学·贵州省药物制剂重点实验室／药用植物功效与利用国家重点实验室·民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004）

心脉通软胶囊具有活血化瘀、通脉止痛的功效，临 床用于冠心病心绞痛心血瘀阻所致胸痹心痛证，症见胸闷、胸部刺痛，固定不移，心悸不宁，现已进入Ⅱ期临床试验。其由荭草、山楂叶、三七等多味中药组方，主药为荭草，有效成分异荭草素、荭草素具有抗氧化、抗凝血、抗菌等作用[1-3]，为荭草中主要活性成分。为有效控制该制剂的质量，本试验中建立了方中荭草、山楂叶和三七鉴别的薄层色谱法和异荭草素、荭草素含量测定的高效液相色谱法，并考察了心脉通软胶囊的稳定性。

1 仪器与试药

仪器：LC-10Avp型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；WD-A型药物稳定性检查仪（天津药典标准仪器厂）；AE2401型电子天平（十万分之一，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；WP-UP-Ⅱ-20型超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）；CX-250型超声波清洗器（功率为250 W，频率为27～34 kHz，北京医疗设备二厂）。

试药：荭草对照药材经贵州医科大学药学院药用植物学与生药学教研室龙庆德副教授鉴定为正品，山楂叶对照药材（批号为121340-200601）、三七对照药材（批号为120941-200807）均购自中国食品药品检定研究院；异荭草素对照品、荭草素对照品（贵州医科大学药物研究开发中心用荭草药材制备，纯度大于98%）；心脉通软胶囊(贵州医科大学药物研究开发中心提供，批号为 20120706，20120715，20120724）；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；硅胶G预制板（青岛海洋化工厂）。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别[4-7]

荭草：取本品内容物 0.3 g，加乙醚 10 mL，超声（功率为 220 W，频率为50 kHz）处理5 min，滤过，弃滤液，滤渣挥干乙醚，加水15 mL溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，挥干，残渣加甲醇1mL溶解，作为供试品溶液；另取荭草对照药材1 g，加乙醇30 mL，加热回流1 h，滤过，挥干，残渣加水15 mL，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，挥干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为对照药材溶液；再按其处方工艺制备不含荭草的阴性样品，照供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2015年版《中国药典（四部）》通则 0502]试验，吸取上述 3种溶液各 2 μL，分别条带状点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（10 ∶0.25 ∶0.25，V／V／V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。结果见图1 A。

山楂叶：取本品内容物 0.2 g，加乙醚 10 mL，超声（功率为 220 W，频率为 50 kHz）处理 5 min，滤过，弃滤液，滤渣挥干乙醚，沉淀加甲醇10 mL，漩涡混匀，滤过，滤液作为供试品溶液；取山楂叶对照药材0.2 g，加乙醇30 mL，加热回流 1.5 h，滤过，挥干，残渣加水 15 mL，用石油醚（60～90℃）20 mL萃取，下层液用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并上层液，挥干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为对照药材溶液；再按其处方工艺制备不含山楂叶的阴性样品，照供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2015年版《中国药典（四部）》通则0502]试验，吸取上述3种溶液各2 μL，分别条带状点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇 -水（2∶1，V／V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。结果见图1 B。

三七：取本品内容物 0.25 g，加乙醚 10 mL，超声（功率为 220 W，频率为 50 kHz）处理 5 min，滤过，弃滤液，滤渣挥干乙醚，加氨试液5 mL溶解，用正丁醇萃取2次，每次5 mL，合并上层溶液，加水5 mL，振摇提取，取上层液，挥干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液；取三七对照药材 0.5 g，加水 5 mL，加正丁醇 5 mL，振摇提取，取上层液，加水15 mL，振摇提取，取上层液挥干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为对照药材溶液；再按其处方工艺制备不含三七的阴性样品，照供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2015年版《中国药典（四部）》通则0502]试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别条带状点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇 -水（65∶30∶10，V／V／V）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于115℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。结果见图1 C。

图1 薄层色谱图

图2 高效液相色谱图

2.2 异荭草素和荭草素含量测定[8-9]

2.2.1 色谱条件

色谱柱：DiamonsiL C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -0.1% 磷酸溶液（15 ∶85，V／V）；检测波长：350 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL ／min。

2.2.2 溶液制备

称取异荭草素、荭草素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释，制成质量浓度分别为 221.0，216.5 μg ／mL的混合对照品溶液。取装量差异项下的本品内容物3 g，精密称定，加乙醚10 mL，超声（功率为220 W，频率为50 kHz）处理5 min，弃乙醚液，沉淀加50%乙醇适量溶解后转移至50 mL容量瓶中，加50%乙醇至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方比例制成缺荭草的阴性样品，按2.3项下方法制得阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取对照品溶液、阴性对照品溶液及供试品溶液各10 μL，按拟订色谱条件测定，记录色谱图。结果，在对照品溶液和供试品溶液色谱图相应位置上，异荭草素、荭草素分别有相同保留时间的色谱峰，且阴性对照无干扰。详见图2。

线性关系考察：精密量取对照品贮备液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，进样测定，绘制工作曲线，计算得异荭草素、荭草素的线性回归方程分别为 Y异＝23 472 860 X异-5 714（r＝0.999 9，n＝5），Y荭＝21 909 536 X荭＋2 195（r＝0.999 7，n＝5）。结果表明，异荭草素和荭草素的质量浓度分别在 11.05 ～88.40 μg／mL 和 10.83 ～86.60 μg／mL范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验：取同一供试品，依法制得供试品溶液，重复进样5次，记录色谱图。结果异荭草素和荭草素峰面积的 RSD分别为 1.52%和 0.63%(n＝5)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，8 h时进样测定，记录色谱图。结果异荭草素和荭草素峰面积的 RSD分别为 1.69%和 1.23%(n＝5)，表明供试品溶液在8 h内稳定。

重复性试验：取同一供试品，依法制备5份供试品溶液，分别进样，记录色谱图。结果异荭草素平均含量分别为 0.287 2% 和 0.178 8% ，RSD 分别为 1.53% 和1.83%(n＝5)，表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取已知含量的供试品（异荭草素和荭草素含量分别为0.287 2%和0.178 8%），分别精密加入异荭草素和荭草素对照品适量，依法制备供试品溶液，按色谱条件进样测定，记录色谱图，计算回收率。结果见表1。

2.3 稳定性考察[10-11]

各项检验项目的质量标准：见表2。

加速试验：取模拟上市包装样品，置温度（40±2）℃、相对湿度（75 ± 5）% 条件下贮藏，分别于 0，1，2，3，6 个月取样，照心脉通软胶囊质量标准检测。结果3批样品经加速试验6个月考察，外观性状、装量差异、崩解时限、微生物限度等各项检测指标均符合规定；3批样品中异荭草素和荭草素含量之和分别为 4.25，4.33，4.14， 4.15， 4.10 mg／粒 （ 批 号 为 20120706）； 3.56，3.71，3.65，3.56，3.51 mg／粒（批号为 20120715）；3.78，3.69，3.89，3.68，3.63 mg ／粒（批号为 20120724）。制剂中异荭草素和荭草素含量无明显变化，且均能检出荭草、山楂叶和三七，符合质量标准要求。

长期试验：取模拟上市包装样品，置室温条件下贮藏，在 0，3，6，12，18，24 个月取样，照心脉通软胶囊质量标准检测。结果经24个月长期试验考察，样品外观性状、装量差异、崩解时限、微生物限度等各项检测指标均符合规定；3批样品中异荭草素和荭草素含量之和分别为 4.25，4.10，4.19，4.31，4.14，4.13 mg／粒（批号为20120706），3.56，3.48，3.71，3.60，3.47，3.48 mg ／粒（批 号 为 20120715），3.78，3.91，3.95，3.82，3.72，3.77 mg ／粒（批号为 20120724）。制剂中异荭草素和荭草素含量无明显变化，且均能检出荭草、山楂叶和三七，符合质量标准要求。

表1 加样回收试验结果（n＝9）

表2 各项检验项目的标准

3 讨论

采用薄层色谱法对心脉通软胶囊中的荭草、山楂叶和三七药材进行定性鉴别，在薄层色谱中分别检出荭草、山楂叶和三七的特征斑点，斑点分离清晰，阴性对照无干扰，专属性强，重复性好，可作为心脉通软胶囊有效的定性鉴别方法。

采用高效液相色谱法测定制剂中异荭草素和荭草素时，由于本品为软胶囊，含有大豆油，为避免污染色谱柱，样品不能直接溶解进样。异荭草素、荭草素为黄酮类化合物，能溶于乙醇等极性溶剂，而不溶于非极性有机溶剂，在供试品溶液制备方法研究过程中，分别采用了石油醚、乙醚、氯仿等溶剂去除样品中油脂类物质，结果表明采用乙醚去除油脂操作简便，效果较好。

在样品稳定性考察试验中，根据《原料药物与制剂稳定性试验指导原则》[2015年版《中国药典（四部）》指导原则9001]，取3批市售制剂，进行加速试验和长期试验考察，除荭草、山楂叶和三七药材的薄层鉴别，以及异荭草素和荭草素的含量测定外，还分别考察了外观性状、崩解时限、微生物限度，均符合质量标准要求。说明本品在24个月内质量稳定，直接接触药品的容器对药品质量无影响，故心脉通软胶囊的有效期暂定为24个月，为控制药品质量及确定药品贮存条件提供了科学依据。