勃氏甜龙竹笋蛋白的提取及双向电泳分析

杨慧敏，吴良如，杨金来，潘雁红，郑友苗

（1.国家林业和草原局竹子研究开发中心，浙江 杭州310012；2.浙江省竹子高效加工重点实验室，浙江 杭州310012）

勃氏甜龙竹（Dendrocalamus brandisii（Munro）Kurz.），系统分类为竹亚科牡竹属，是优质的大型丛生笋材两用竹。主要分布于亚洲热带和南亚热带的缅甸、老挝、越南、泰国北部和中国云南省，广东省、福建省有栽培［1］。勃氏甜龙竹的正常发笋期6-10月，笋重1～3 kg，笋体洁白粗壮，笋肉鲜嫩，甘甜爽脆，丰产性好，年产可达30 t·hm-2以上［1］。杨宇明等［2］测定每100 g竹笋含粗蛋白1.95 g。裴佳龙等［3］对云南4个不同地理种源的勃氏甜龙竹每100 g竹笋的粗蛋白进行测定，含量分别是陇川2.13 g，石屏2.11 g，思茅1.89 g，沧源1.20 g；陇川种源的蛋白含量最高，石屏和思茅种源的蛋白含量差异不显著，而沧源种源的蛋白质含量最低。

蛋白质是基因表达的最终产物，最为直接反映细胞代谢和表型，可用于补充基因组和基因表达研究［4］。双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）是从细胞、组织或其他生物样品中提取的蛋白混合物最有力和应用最广泛的实验技术。双向凝胶电泳图谱中蛋白点的数量和质量则直接反映了样品中蛋白质信息的完整性［5］，因此建立一套分辨率高和重复性好的双向电泳体系是开展蛋白质组研究的关键。

竹笋是从竹子根状茎上萌发分化而成的膨大的芽和幼嫩的茎，常含有许多次生代谢产物，如酚类、甾醇类、多糖、盐离子，同时也可能含有其他干扰物质，如核酸、多糖、酚、脂类、醌等［6-7］，这就导致蛋白质的提纯非常困难，从而增加其蛋白双向电泳的技术难度。因此，研究采用TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取其竹笋总蛋白，pH 3～10和pH 4～7的IPG胶条进行蛋白双向电泳研究，以期建立勃氏甜龙竹笋蛋白的双向电泳体系，并通过PDquest软件分析，了解其蛋白的等电点和分子量的分布情况，为后续开展相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试竹笋 勃氏甜龙竹笋2018年7月20日采集自云南省普洱市思茅区南屏镇曼歇坝村。

1.1.2 主要试剂及试剂盒

酚抽提液：0.7 M蔗糖，0.1 M KCl，0.5 M Tris-HCl（pH 7.5），50 mM EDTA，0.2%DTT）。

蛋白质裂解液：尿素7 M，硫脲2 M，CHAPS（3-［（3-胆酰胺丙基）-二乙胺］-丙磺酸）4%，DTT（二硫苏糖醇）65 m，Bio-Rad Ampholyte 0.5%，PMSF（苯甲基磺酰氟）1 mM。

胶条平衡缓冲液母液：尿素6 M，SDS 2%，Tris-HCl（1.5 M，pH 8.8）0.375 M，甘油20%。

封胶液：低熔点琼脂糖0.5%，Tris 25 mM，甘氨酸192 mM，SDS 0.1%，溴酚蓝0.001%。

ReadyStrip IPG Strip pH 3～10，24 cm、IPG Buffer pH 3～10、ReadyStrip IPG Strip pH 4～7，24 cm、IPG Buffer pH 4～7、2D Equilibration Buffer（货号：SD6030）购自GE Healthcare公司。

改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒（货号：C503041）和灵敏型蛋白质快速染色试剂盒（货号：C510039）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 分光光度仪（Evolution 200，赛默飞世尔科技）；IPGhor等电聚焦仪（GE Healthcare）：Ettan DALT电泳系统（GE Healthcare）；凝胶扫描仪（GE Healthcare）。

1.2 方法

1.2.1 竹笋总蛋白提取 将竹笋样品放于研钵中，加液氮研磨粉碎，并在研磨过程中加入适量聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

TCA／丙酮法：将磨好的样品粉末放入50 mL离心管中，加入预冷的10% 三氯乙酸（TCA）-丙酮溶液（含0.1% DTT和1mM PMSF），在-20℃冰箱中静置过夜，4℃，12 000 rpm离心20 min，弃上清。在沉淀物中加入预冷的丙酮溶液（含0.1% DTT和1 mM PMSF），-20℃静置2 h，4℃，15 000 rpm，离心20 min，弃上清，取沉淀，冻干30 min，即为总蛋白粉末。

改良TCA-酚法：将液氮研磨好的样品粉末，按照1∶10的比例加入预冷的含10%TCA的丙酮，-20℃沉淀1 h。4℃，12 000 rpm离心15 min，弃上清，取沉淀，加入预冷的丙酮，-20℃沉淀1 h。重复以上步骤1次。4℃，12 000 rpm离心15 min，弃上清，取沉淀，真空冷冻干燥成粉末后加入等体积的酚-Tris-HCl（pH 7.5）饱和溶液，4℃下振荡混匀30 min后6 800 rpm离心30 min，吸取酚上层，加入等体积的酚抽提液。重复以上步骤1次。吸取酚上层，加入5倍体积预冷的0.1 M醋酸铵-甲醇溶液，-20℃沉淀1 h。4℃，12 000 rpm离心30 min，弃上清，取沉淀。加入2倍体积预冷的甲醇清洗，轻微振荡混合。4℃，12 000 rpm离心10 min，弃上清，取沉淀。重复以上步骤3次。丙酮代替甲醇再次重复以上步骤3次。4℃，12 000 rpm离心10 min，弃上清，取沉淀，冻干30 min，即为总蛋白粉末。

各取100μg蛋白质粉末于2 mL离心管中，加入800μL蛋白质裂解液，30℃水浴1 h，充分溶解后，25℃，12 000 rpm离心15 min，取上清；并再次离心，取上清，即为勃氏甜龙笋的总蛋白溶液。

1.2.2 竹笋蛋白浓度的测定 采用改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒测定竹笋蛋白的浓度，具体步骤详见其使用说明书。

1.2.3 双向电泳

（1）等电聚焦电泳。选用24 cm、pH 3～10或pH 4～7 IPG预制干胶条，进行第一向的等电聚焦，蛋白上样量为1 500μg。在50 V预电泳14 h后正式电泳，电泳参数见表1。

表1 电泳分析条件Tab.1 Conditions for electrophoretic analysis

（2）胶条平衡。将等电聚焦完成后的每根胶条加平衡液1（胶条平衡缓冲母液中加1% DTT）10 mL，摇床平衡15 min。清洗胶条，加入平衡母液2（胶条平衡缓冲母液中加2.5% IAA），摇床平衡15 min。

（3）SDS-PAGE凝胶电泳。将平衡后的胶条放入凝胶板中，加入封胶液，室温静置20 min后开始第二向的SDS-PAGE凝胶电泳。凝胶浓度为12%。预电泳参数设定为：70V，60 min，正式电泳参数设定为：300 V，至溴酚蓝离胶下沿0.5 cm处停止；冷却循环温度设定为16℃。

（4）凝胶染色。电泳结束后，轻轻撬开玻璃，取出凝胶，用超纯水冲洗凝胶，采用上海生工灵敏型蛋白质快速染色试剂盒进行染色，具体步骤详见其使用说明书。

（5）凝胶图谱扫描。采用GE Healthcare凝胶扫描仪，300 dpi分辨率，对染色后的凝胶进行扫描。使用PDquest 8.0软件对凝胶图谱上的蛋白点进行检定、匹配和编辑、数据分析和输出，计算各蛋白点的等电点和相对分子质量。

图1 牛血清白蛋白的标准曲线Fig.1 The standard curve of BSA

2 结果与分析

2.1 2种方法提取竹笋总蛋白的定量结果

采用分光光度计，以超纯水为空白对照，牛血清蛋白（BSA）为标准蛋白，在595 nm处测定各不同浓度梯度的BSA标准溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图1。

标准曲线做线性回归，得到的方程为：y＝0.029x-0.013，R2＝0.999。TCA／丙酮法提取的勃氏甜龙竹笋总蛋白平均吸光度为0.168，计算得到的其蛋白浓度为6.098 mg·mL-1；而改良TCA-酚法提取的总蛋白平均吸光度为0.159，计算得到其蛋白浓度为5.783 2 mg·mL-1。可见，TCA／丙酮法提取的总蛋白的得率要高于改良TCA-酚法。

2.2 2种方法提取竹笋总蛋白的双向电泳结果

图2分别为TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取的总蛋白的双向电泳凝胶图谱。经PDquest 8.0软件分析，TCA／丙酮法提取的总蛋白，共分离出约726个蛋白点；而改良TCA-酚法提取的总蛋白，共分离出约511个蛋白点。可见，TCA／丙酮法比改良TCA-酚法能提取更多的竹笋蛋白种类。

图2 TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取的竹笋总蛋白的双向电泳凝胶图谱Fig.2 The two dimensional gel electrophoresis pattern of total protein of bamboo shoots extracted respectively by using TCA／acetone method and modified TCA-phenol method

图3 TCA／丙酮法和改良TCA-酚法在不同等电点范围的蛋白点数比较图Fig.3 The comparison of protein spots of isoelectric point distribution between TCA／acetone method and modified TCA-phenol method

2.2.1 不同等电点范围的蛋白点数的比较 图3为TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取的竹笋蛋白在各不同等电点范围内的蛋白点数的比较图。由图3可见，TCA／丙酮法提取的蛋白点数在不同等电点范围内比改良TCA-酚法普遍都高，尤以酸性端更显著；竹笋蛋白主要集中在pH 4～7，其中TCA／丙酮法占92.29%，改良TCA-酚法为90.41%，可见，勃氏甜龙竹笋以酸性蛋白为主。另外，改良TCA-酚法却在碱性端pH 8～9范围内的蛋白点数高于TCA／丙酮法，其提取的碱性蛋白占总蛋白的8.21%，而TCA／丙酮法为5.09%，可见，改良TCA-酚法在碱性蛋白提取方面要优于TCA／丙酮法。

2.2.2 不同相对分子质量范围的蛋白点数的比较 图4为TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取的竹笋蛋白在各不同相对分子量范围内的蛋白点数的比较图。由图4可见，勃氏甜龙竹的笋蛋白在10～120 kDa范围内都有分布，并呈现3个峰，一个在10～40 kDa，一个在40～80 kDa，一个在80～120 kDa；竹笋蛋白主要集中在10～40 kDa范围内，其中TCA／丙酮法占58.95%，改良TCA-酚法为48.14%，可见，勃氏甜龙笋主要是以分子量低的蛋白为主。另外，TCA／丙酮法提取的蛋白在不同相对分子量范围内比改良TCA-酚法普遍都高，仅在70～80 kDa范围内略低于改良TAC-酚法，可见，TCA／丙酮法更适合于勃氏甜龙笋蛋白的提取。

2.3 不同p H胶条对蛋白双向电泳效果的影响

为了进一步观察竹笋总蛋白在双向电泳图谱上的分布情况，试验分别采用24 cm，pH 3～10和pH 4～7的IPG预制干胶条对TCA／丙酮法提取的总蛋白进行双向电泳，结果见图5。经PDquest 8.0软件分析，pH 3～10胶条，共分离出约726个蛋白点；而pH 4～7胶条，共分离出约1 196个蛋白点。从图中我们可以看出，勃氏甜龙竹的笋蛋白点大多分布在凝胶图谱的酸性端，而在凝胶图谱的碱性端分布的比较少。pH 3～10的胶条图谱上的蛋白点数量少，绝大部分都集中在pH 4～7范围内。在pH 4～6间的中、高分子量的蛋白质点分布非常密集，紧邻甚至重叠在一起，没有进行有效的分离。另外，图谱的碱性端蛋白点相对较少，而且连成线条状，没有有效地分离开。而pH 4～7的胶条得到的双向电泳图谱上的蛋白点数量多，分离得比较开，蛋白点的分布也相对均匀，分离效果比较好，所以选用pH 4～7的胶条更合适。

图4 TCA／丙酮法和改良TCA-酚法在不同相对分子质量范围的蛋白点数比较图Fig.4 The comparsion of protein spots of relative molecular mass distribution between TCA／acetone method and modified TCA-phenol method

图5 采用p H 3～10和pH 4～7胶条的竹笋总蛋白双向电泳图谱Fig.5 The two dimensional gel electrophoresis pattern of total protein of bamboo shoots using pH 3-10 and pH 4-7 IPG Strip

2.3.1 不同等电点范围的蛋白点数的比较 图6为勃氏甜龙竹笋总蛋白采用pH 3～10和pH 4～7不同胶条双向电泳后在不同等电点范围的蛋白点数的比较图。由图6可知，pH 3～10胶条的双向电泳图谱共检测到蛋白点726个，其中pH 4～7范围内的蛋白点分布较多，约670个，占蛋白点总数的92.29%；而pH 3～4和pH 7～10范围内的蛋白质点分布较少，分别为19个和37个，占蛋白质点总数的7.71%，可见勃氏甜龙竹的笋蛋白主要以酸性蛋白为主，碱性蛋白很少。pH 4～7胶条的双向电泳图谱共检测到蛋白点数1 196个，明显多于pH 3～10图谱中此范围的蛋白点数（670个），是后者的1.785倍多，其中pH 4～5范围内是1.43倍，pH 5～6范围内是1.72倍，pH 6～7范围内甚至达到4倍，可见，使用不同pH范围胶条可提高特定范围内蛋白质点的分辨率。因此，采用pH 4～7胶条比pH 3～10胶条获得更多的蛋白点，而且蛋白点清晰可见，蛋白得到了有效的分离。

2.3.2 不同相对分子质量范围的蛋白点数比较 图7为勃氏甜龙竹笋总蛋白采用pH 3～10和pH 4～7不同胶条双向电泳后在各不同相对分子质量范围的蛋白点数的比较图。由图7可知，采用pH 4～7胶条在各不同相对分子质量范围内比pH 3～10胶条分离更多的蛋白点，在40～50 kDa范围内，甚至是pH 3～10胶条的3.77倍，其次在30～40 kDa范围内，达1.91倍。可见pH 4～7胶条更适合分离勃氏甜龙笋的蛋白。

图6 pH 3～10和pH 4～7胶条上不同等电点范围的蛋白点数的比较Fig.6 The comparison of protein spots of isoelectric point distribution between pH 3-10和pH 4-7 IPG Strip

图7 pH 3～10和pH 4～7胶条上不同相对分子质量范围的蛋白点数的比较Fig.7 The comparison of protein spots of relative molecular mass distribution between pH 3-10和pH 4-7 IPG Strip

3 讨论

蛋白质提取和样品制备是蛋白双向电泳成功的前提和关键。目前提取植物蛋白的方法有很多，但由于不同植物或组织的生物学特性、生理生化特征有很大的差异，因此需要摸索出适合于不同植物及不同组织的最佳的蛋白提取方法以及双向电泳条件。竹笋中富含的酚类、多糖、醌类、甾醇类等次生代谢产物会干扰蛋白的提纯及双向电泳。研究分析比较了TCA／丙酮法和改良TCA-酚法提取竹笋总蛋白。TCA／丙酮法是传统的且应用普遍的蛋白提取方法，首先，预冷后的TCA／丙酮溶液能有效地抑制生物样品中的蛋白酶活性，减少样品中的蛋白被这些蛋白酶所降解；其次，在提取过程中增加了洗涤和沉淀蛋白的次数则可以有效去除酚类、多糖、核酸等杂质，从而获得纯度更高的蛋白［8］。改良酚法则可能由于，其提取步骤过于繁琐，步骤过多，导致损失的蛋白较多，使得电泳图谱上获得的有效蛋白点数过少，而不适用于勃氏甜龙竹笋蛋白的提取。

研究表明采用24 cm、pH 4～7的IPG胶条，不仅实现了竹笋蛋白的有效分离，使每个pH单位鉴定出的蛋白点数目显著增多，而且也使更多的低丰度蛋白显现和分离出来。因此，采用pH 4～7窄范围的IPG胶条比pH 3～10宽范围的IPG胶条获得的蛋白点数更多，反映的蛋白质信息量更大，蛋白分离的效果更佳，因此，更适合于勃氏甜龙竹笋蛋白的双向电泳。

勃氏甜龙竹的笋蛋白在pH 3～10范围内都有分布，但主要集中在pH 4～7范围，以酸性蛋白为主（占92.29%），这与Ong等［9］报道的植物蛋白绝大部分都属于酸性蛋白，并且功能性蛋白大多位于等电点pH 4～7的区域内［10-12］相一致。勃氏甜龙竹的笋蛋白的分子量主要在10～40 kDa之间，这与毛竹笋（45～116 kDa）［13］、雷竹笋（45～116 kDa）［14］的蛋白质明显不同，以低分子量的蛋白为主。