HPLC法测定中偏康合剂中黄芪甲苷的含量

1.云南省执业药师注册中心，云南 昆明 650101 ；2.云南省曲靖市第一人民医院，云南 曲靖 655000；3.云南健测检验检测技术有限公司，云南 曲靖 655000

中偏康合剂为云南省曲靖市第一人民医院制剂室研制的制剂，由黄芪、三七、当归等组成，具有补气、活血、化瘀、通络等功效，主要用于气虚络塞、口眼歪斜、语言蹇涩、口角流涎、下肢瘘废、小便频数等症。其中黄芪为君药，首载于《神农本草经》，为豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄芪的干燥根，性温，归脾、肺经，具有补气升阳、生津养血、行滞通痹等功效。黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一，具有抗炎、调节免疫、抗氧化、抗细胞凋亡、调节代谢、抗肿瘤等药理作用[1]。2015版《中国药典(一部)》以黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量作为黄芪质量评价指标[2]。中偏康合剂所含成分复杂，现行版质量标准中仅以薄层色谱法鉴别其中三七、赤芍两种药材，不能完全体现药品的质量。为了更加有效对本药进行质量控制，本实验参照文献[2-7]，以黄芪甲苷为定量指标，采用HPLC-ELSD法进行中偏康合剂中黄芪甲苷含量测定方法，为中偏康质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-2030C 3D高效液相色谱仪(岛津)，ELSD-LTⅡ蒸发光检测器，ME104电子分析天平，ME55电子分析天平。

1.2 材料 黄芪甲苷对照品(批号：110781-201616，纯度为97.4%，中国食品药品检定研究院)，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件Angilent ZORBAX C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(32：68)，检测器为蒸发光检测器，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，氮气流速为350 kpa。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取本品25 mL，精密量取，置锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 mL，蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次30 mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品(含量97.4%) 11.1756 mg，加甲醇溶解稀释至25 mL，制成每1 mL含0.4354 mg对照品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按中偏康口服液的处方和制法，制成不含黄芪的药液，再按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性实验 取2.2项下制备的样品溶液按照2.1的色谱条件分别进样10 μL进行测定，结果显示，色谱图在黄芪甲苷对照品相应保留时间处无吸收峰，表明阴性对照无干扰。

2.4 线性关系考察 精密吸取2.2.2黄芪甲苷对照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL进样，按“2.1”色谱条件下测定，以进样质量的(X)为横坐标，色谱峰面积(Y)为纵坐标进行计算指数，绘制标准曲线，得到标准曲线方程为Y=X1.52644*EXP(9.93932)。相关系数为0.9994。结果表明，黄芪甲苷对照品在2.177～13.062 μg范围内，线性关系良好。

2.5 精密度考察 精密吸取2.2.2的黄芪甲苷对照品溶液20 μL，按“2.1”色谱条件下连续进样6次，记录色谱峰的峰面积，结果峰面积的RSD%为1.11% 。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取中偏康口服液(曲靖市第一人民医院，20171206)25 mL，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，平行操作6份，按“2.1”色谱条件下各进样20 μL进行测定，记录色谱峰的峰面积，计算结果含量的RSD为1.17%。表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取中偏康口服液(曲靖市第一人民医院，20171206)25 mL，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别于0、2、8、24、32、48 h按“2.1”色谱条件下各进样20 μL进行测定，记录色谱峰面积，结果峰面积的RSD为1.84%，表明样品在48 h内稳定。

2.8 回收率试验 精密吸取中偏康口服液(曲靖市第一人民医院，20190118，含量0.24 mg/mL)12.5 mL，共6份，精密吸取黄芪甲苷对照品溶液(0.9039 mg/mL)3.0 mL，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”色谱条件，精密吸取6份供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，计算黄芪甲苷的平均加样回收率，平均回收率为93.0%,回收率良好，RSD为1.25%，符合分析方法的要求。见表1。

2.9 含量测定取3批中偏康口服液，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定，外标法计算各供试品溶液中黄芪甲苷的含量。见表2。

表1 黄芪甲苷加样回收率测定结果

表2 中偏康口服液中黄芪甲苷的含量

3 讨论

3.1 流动相选择 先后考察了[7]甲醇-水(76∶24)及乙腈-水(32∶68)、(33∶67)、(36∶64)及流速分别为0.8 mL/min和1.0 mL/min，柱温25℃、30℃、35℃的条件，结果发现，在乙腈-水(32∶68)作为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃的条件时，分离度良好，保留时间合适，且阴性对照溶液无干扰。

3.2 样品制备方法选择 分别考察超声提取(30 min，60 min，120 min)和回流提取(30 min，60 min，120 min)两种提取方法及不同溶剂(65%甲醇、85%甲醇、甲醇、65%乙醇、85%乙醇、甲醇)，结果发现，回流提取率较超声提取高，60 min和120 min提取的样品含量较高，但差异不大，且甲醇提取效率较高。因此确定样品制备方法为回流提取60 min，甲醇作为提取溶剂。

3.3 氨试液萃取次数选择 分别采用氨试液萃取0、1、 2、3 次，结果表明，洗涤2次、3次后样品含量较高，且萃取 2 次与 3 次效果无明显差异，因此采用氨试液2 次萃取。

综上所述，本实验采用高效液相色谱法测定中偏康合剂中黄芪甲苷的含量，方法简便，精密度高，稳定性好，故可作为中偏康合剂质量控制的方法之一，为中偏康合剂质量标准的进一步完善提供依据。