白藜芦醇苷的体外抗氧化活性研究

泰州职业技术学院，江苏 泰州 225300

白藜芦醇苷(polydatin，PD)即3,4′5-三羟基-3-β-D-吡喃葡萄糖苷，是传统中药虎杖中的有效成分，具有抗癌、抗凋亡、调控细胞增殖与自噬等药理活性[1-2]，另外，白藜芦醇苷能够通过抗炎进而发挥对心血管系统的保护作用[3]。研究发现，多种心血管疾病都伴随着氧自由基的过量生成，并且机体过度氧化应激能够参与心血管疾病的发生和发展[4-5]。因此，应用抗氧化活性物质、增强机体抗氧化防御系统，改善机体氧化应激状态，可能成为心血管疾病新的治疗靶向。研究以白藜芦醇苷为研究对象，考察其体外抗氧化活性，以期为白藜芦醇苷的心血管疾病保护作用提供一定的理论基础和依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；MS204TS型分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)。

1.2 材料 白藜芦醇苷(批号：15721)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH，批号：D9132)、1,10-菲罗啉(批号：GG240128)均购自美国Sigma-Aldrich公司；铁氰化钾(批号：DF230103)、硫酸亚铁(批号：GD260142)、硫代巴比妥酸(批号：FA090131)、三氯乙酸(批号：DG100100)购自萨恩化学技术(上海)有限公司；乙醇(批号：20180706)、H2O2(批号：20180615)为国药集团化学试剂有限公司，所有均为分析纯。

2 方法

2.1 白藜芦醇苷对羟基自由基清除能力的测定 取2.1 mM 1,10-菲罗啉溶液1 mL置入试管中，加入2 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)和1 mL双蒸水混匀，再加入1 mL硫酸亚铁溶液混匀，最后加入1 mL H2O2溶液，37 ℃温育60 min，在536 nm波长下测定吸光度，为A(损)；用1 mL蒸馏水代替H2O2，测的吸光度值为未损伤管A(未)；用不同浓度样品溶液代替双蒸水，测出的吸光度为A(样)。

清除率(%)=[A(样)-A(损)]/[A(未)-A(损)]×100

2.2 白藜芦醇苷对DPPH自由基清除能力的测定 取不同浓度样品溶液2 mL和DPPH·溶液2 mL加入到试管中摇匀、室温静置30 min，在517 nm波长处测定吸光度值 Ai；在2 mL DPPH·标准溶液中加入2 mL无水乙醇，震荡混合，在517 nm波长处测定吸光度值A0；试管中加入2 mL不同浓度的样品溶液和2 mL无水乙醇，摇匀、避光放置30 min后，在517 nm波长处测定吸光值Aj。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

2.3 白藜芦醇苷对脂质过氧化物抑制作用的测定 新鲜鸡蛋去卵清，卵黄用等体积的PBS缓冲液配制成1∶1的卵黄悬液，同方向匀速搅拌10 min，再用PBS稀释成1∶25的卵黄悬液。吸取卵黄悬液 0.2 mL，分别加入0.1 mL不同浓度样品溶液，0.2 mL 25 mM硫酸亚铁溶液，加入1.5 mL PBS缓冲液，在37℃水浴下反应30 min，加1 mL 20%三氯乙酸，混匀3500 r/min离心15 min，取上清液2 mL，加1 mL 0.8%硫代巴比妥酸溶液，沸水浴15 min冷却后532 nm下测定吸光度值，以0.1 mL蒸馏水代替样品作为空白对照管。

清除率=(A0-A)/A0×100%；其中，A0为空白对照管吸光度，A为样品吸光度。

2.4 白藜芦醇苷还原铁离子能力的测定 在试管中加入0.5 mL样品溶液，2.5 mL的PBS缓冲液和2.5 mL铁氰化钾溶液，震荡均匀，50℃水浴20 min，流水冷却，然后加入2.5 mL三氯乙酸溶液。混匀后，用3000 r/min离心10 min。吸取上清液2.5 mL置于新的离心管中，再加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL三氯化铁溶液，混合均匀后，用紫外分光光度计在700 nm波长下测定吸光度。吸光度越大表明样品还原能力越强。

3 结果

3.1 白藜芦醇苷对羟基自由基清除的影响 机体过量的自由基则会引起蛋白质变性、酶失活、多糖降解、DNA链断裂、生物膜结构损伤、细胞解体乃至机体病变和死亡。从图1可知，随着白藜芦醇苷浓度增加，其对羟基自由基的清除率逐渐增大，提示白藜芦醇苷具有一定的清除羟基自由基的作用。

3.2 白藜芦醇苷对DPPH·自由基清除的影响 DPPH自由基溶液在517 nm处有强吸收，每个DPPH分子在溶液中可生成一个稳定的含氮自由基，具有典型紫色，当它与提供1个电子的自由基清除剂作用时，生成无色产物，使溶液的典型紫色变浅。由图2可知，随着白藜芦醇苷浓度的增加，其对DPPH自由基的清除率增大。当白藜芦醇苷浓度为0.5 mg/mL时，DPPH 自由基清除率为48.05%，揭示白藜芦醇苷具有一定的体外抗氧化活性。

3.3 白藜芦醇苷对脂质过氧化物抑制作用的影响 过氧化脂质降解产生的丙二醛，与硫代巴比妥酸发生缩合反应生成红色产物，在 532 nm处有最大吸收。随着白藜芦醇苷浓度的增加，白藜芦醇苷对卵黄脂蛋白体系中脂质过氧化作用抑制率也随之增加，其抑制作用与白藜芦醇苷浓度呈现一定的量效关系。从图3可知，白藜芦醇苷对卵黄脂蛋白脂质过氧化物具有一定的抑制作用。

3.4 白藜芦醇苷还原铁离子能力的测定 一般情况下，物质的还原能力与其抗氧化能力成正比，还原能力强的物质可作为电子供体，使自由基变成稳定形态，从而起到抗氧化的作用。在该反应过程中，Fe3+可被抗氧化物质还原成为Fe2+后在700 nm波长下具有强吸收。因此，吸光度越大表明样品还原能力越强。由图4可知，随着白藜芦醇苷浓度的增加，体系吸光度越大，表明白藜芦醇苷具有一定的还原力。

4 讨论

羟基自由基、过氧化氢及超氧阴离子自由基等是生物体内主要的活性氧自由基，它们引发体内脂质过氧化是机体衰老、动脉粥样硬化、心血管疾病及肿瘤发生的重要原因。因此，有关抗氧化清除自由基的作用以及天然抗氧化活性小分子化合物筛选得到普遍的关注。研究从白藜芦醇苷对羟基自由基和DPPH·自由基的清除作用，对脂质过氧化物的抑制作用和铁离子的还原能力4个方面对白藜芦醇苷的体外抗氧化进行了研究。结果表明，白藜芦醇苷能够清除羟基自由基和DPPH自由基，并且具有一定的脂质过氧化物抑制和铁离子还原能力。因此，白藜芦醇苷具有一定的体外抗氧化活性，可能作为潜在的抗氧化剂。

有研究表明，氧化应激在心血管疾病的发生发展过程中发挥着至关重要的作用[6]。本实验表明，白藜芦醇苷在体外具有一定的抗氧化活性，这可能为揭示白藜芦醇苷的心血管疾病保护作用提供一定新的理论基础。