转几丁质酶基因甜瓜植株的获得及生物学鉴定

杨晋明，王 铭，杜建中

（山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原 030031）

甜瓜（Cucumis melo L.）在我国有着悠久的栽培历史，因香甜可口和降暑的作用而受到人们的喜爱，尤其是高度进化的网纹甜瓜更是以高档水果的身份进入现代消费社会，作为四季常鲜的水果，受到各界人士的青睐，售价居高不下，产品畅销国内外。我国长江以南地区利用大棚秋季栽培网纹甜瓜，具有较高的经济效益和社会效益。然而在生产上，甜瓜的栽培管理会受到各种病害的严重制约，如枯萎病、白粉病、蔓枯病等真菌性病害，正常年份可造成甜瓜10%～15%的产量损失，发病严重时损失可高达30%[1]。常规育种技术虽然使新培育的甜瓜品种抗性有所提高，但由于受到资源限制，仍无法满足生产上的需求。生物技术的诞生为农业生产开辟了一条崭新的育种途径，科学家采用基因工程技术将一些能够提升植物抗病性的基因导入植株，获得了一些抗病性植株。

转基因技术应用在甜瓜性状改良和育种上，起步于上世纪末。国外，1990年美国Michigan 州立大学的Fang 和Grumet[2]采用农杆菌介导法将抗卡那霉素基因（NPTⅡ）导入甜瓜，开启了转基因技术创制和培育甜瓜新品种的新纪元；1993年，Yoshikawa等[3]将黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因（CMV-CP）导入甜瓜；1997年，Fuchs等[4]将得到的抗小西葫芦黄花叶病毒、抗黄瓜花叶病毒和抗西瓜花叶病毒2号的甜瓜品系，在大田做生物学鉴定，结果发现，转基因个体的病毒侵染率在8%～33%，而对照的病毒感染率高达99%；与非转化体相比，转基因植株产量提高了62%左右，甜瓜的商品率增加60%。国内，甜瓜转基因研究开始稍晚一些，1994年，孙严等[5]采用农杆菌介导法将CMV外壳蛋白cDNA基因导入甜瓜，获得了抗CMV的甜瓜植株；2001年，钟俐等[6]采用农杆菌介导法将雪花莲凝集素（GNA）基因导入甜瓜品种皇后和伽师瓜，饲蚜试验结果证明，转化植株获得了棉蚜抗性；2006年，黄永红[7]用农杆菌介导法将甜瓜ACC氧化酶导入甜瓜品种‘gt-1’，使得转化植株果实的耐贮藏性提高；2014年，郝金凤等[8]以河套甜瓜原种为试验材料，以甜瓜腋芽生长点作为外植体，根据农杆菌菌液浓度和处理时间的不同配置，建立和优化了甜瓜生长点农杆菌介导法的转化体系，获得了阳性植株。

关于几丁质酶基因导入甜瓜的研究，目前国内外，仅见2003年葛屹松[9]等人的报道，该课题组将抗真菌蛋白几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因导入皇后、红蜜脆等甜瓜品种，经分子检测证明获得了转化植株，目的基因在转化植株中得到了表达。

甜瓜导入几丁质酶基因可以预防某些甜瓜的真菌病原菌的危害，其作用机制：转化几丁质酶基因的植株所表达的几丁质酶能够降解真菌细胞壁上的几丁质，从而使真菌裂解和无法正常繁殖，达到防治真菌侵害和危害的目的。

鉴于此前有关几丁质酶基因转化甜瓜的文献较少，而且这些文献也仅仅是报道得到转化植株，对转化几丁质酶基因的植株的真菌病抗性仍缺少进一步的研究，因此针对几丁质酶基因转化甜瓜的研究是很有必要的。

本文拟以农杆菌介导法将水稻几丁质酶基因导入甜瓜品种，在获得转化植株的基础上，探讨几丁质酶基因转化个体（株系）对真菌病——白粉病的抗性变化。

1 材料和方法

1.1 植物材料和质粒

以本课题组保存的甜瓜品种雪脆蜜2号作为转化对象，进一步研究转化植株对白粉病的抗性变化。

转化用质粒为pGI 11一RC-1（图1）由本中心基因工程研究室友情提供。其携带有水稻几丁质酶基因和潮霉素抗性基因，农杆菌菌株为LBA4404。

图1 质粒pGL II-RC-1结构图

1.2 转化方法

1.2.1 农杆菌菌液培养

挑取含有质粒pGI 11一RC-1的农杆菌单菌落，接种于YEP液体培养基中，28℃培养48h。取出菌液用YEP液体培养基稀释至OD600值为0.2～0.4，4℃冰箱临时保存备用。

1.2.2 外植体制备、培养及转化

种子消毒、外植体制备、再生体系的建立及外植体转化方法参见葛屹松[9]文献。

1.3 分子检测

1.3.1 取样和DNA提取

所有再生植株全部取样，即摘取其幼嫩叶片500mg左右，采用CTAB法[10]提取植物DNA，同时按碱裂解法[11]提取质粒DNA。

1.3.2 PCR检测

以非转化植株的样品为阴性对照，质粒DNA为阳性对照。样品的PCR扩增引物、扩增体系配制和扩增条件参见杜建中[12]文献。

1.3.3 Southern blot杂交分析

取PCR检测结果为阳性的植株的DNA进行Southern blot检测，所用试剂盒是Roche公司生产的DIG DNA Labling and Detection Kit。对PCR检测结果为阳性的植株DNA全部进行Southern blot杂交分析。待检样品DNA、阴性对照DNA、质粒DNA均用Hind Ⅲ 酶切，酶切反应体系总体积25μL，其中10×buffer 2.5μL，DNA溶液10μL，限制性内切酶5μL，加水7.5μL。反应管5000 r/min离心15 s，然后37℃水浴中酶切过夜。酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离4h。随后的DNA处理方法参见《现代分子生物学实验技术》[13]。杂交用探针按试剂盒说明书制备，用CSPD（Roche）荧光染色杂交条带，并 X-光片自显影曝光。试验同时设阴性对照、阳性对照。

1.4 转化植株抗病性的生物学鉴定

1.4.1 采集病原菌、制备分生孢子悬浮液

从田间采集感病的甜瓜叶片，冷冻保存。参见邓丽君等[14]方法制备病原菌分生孢子悬浮液备用。

1.4.2 田间接种病原菌

移栽转基因甜瓜植株和非转化植株至温室，每个处理各9株，3次重复。5叶期采用邓丽君等[14]的孢子悬浮液喷雾接种法进行田间接种，接种一周后开始田间调查记录，3周时调查发病情况。病情指数（DI）计算公式如下，参见邓丽君等[14]文献。

分级标准按照《中国蔬菜病虫预测预报》的方法[15]。活体植株接种病情分级标准和白粉病抗感分级标准参见邓丽君等[14]文献。

2 结果分析

2.1 再生转化苗的获得

通过培养、转化，共获得再生转化苗213株，其中有11株根系不发达，苗势较弱，淘汰。其余202株全部取样进行PCR检测。

2.2 分子检测结果

2.2.1 PCR检测

202个待测样品中，经PCR扩增检测，发现有17株材料的样品中有目的基因的存在，认定为疑似转化植株。图2为部分材料的PCR扩增产物的凝胶电泳结果。由图中可以看出，阴性对照无特异扩增条带出现，证明扩增体系和反应条件是正确的，1～8号转基因植株的DNA扩增产物呈现与阳性对照大小一致的特异扩增条带（376bp），证实这些转基因植株的DNA中包含有目的基因几丁质酶基因的序列。

图2 转基因植株的PCR检测结果

2.2.2 Southern blot杂交分析

17株认定的疑似转化植株，经Southern blot杂交分析，发现11个植株的DNA中，杂交出与阳性对照DNA同样大小的特异杂交条带，证明转基因植株中目的基因业已整合到甜瓜的基因组上，确为转基因植株。11个转基因植株的杂交分析中，有1株出现3条杂交条带，另一株出现2条杂交条带，剩余9株均只出现一条杂交带，选取这9株进行快繁，以便有足够的移栽苗进行田间播种进一步做抗病生物学鉴定。图3为这9个转基因植株DNA的Southern blou杂交结果，可以看出，除了阴性对照没有任何杂交条带外，阳性对照和9个转基因植株均显现出特异的杂交条带。

图3 转基因材料的Southern blot杂交结果

2.3 抗病生物学鉴定

9个转化植株（或后代）接种病原菌后，通过调查、计算和分析，其抗病性鉴定结果见表1。

由表1可以看出，阴性对照发病率100%，证明白粉病菌的田间接种成功。转基因材料，除T9外，其余8个转化植株的植株均达到抗病标准，其中T3达到高抗病水平，其它为中抗或抗病。但各植株的白粉病抗性之间仍存在差异，这可能与目的基因在各个体中的表达与否或表达水平有关，有关这个问题以及目的基因在转化植株中的遗传、表达规律和抗性仍需进一步研究。

表1 转基因甜瓜植株田间接种白粉病菌的抗病鉴定结果

本研究证明，农杆菌介导法转化甜瓜的转化率在4%～5%之间，通过转化可获得转水稻几丁质酶基因的甜瓜植株，几丁质酶基因的导入赋予这些转基因植株白粉病抗性，一般可提高2～4个抗性级别。因此通过筛选能够培育出高抗白粉病的转基因甜瓜品种。

3 讨论

感染白粉病的甜瓜生长缓慢，使得甜瓜无法完成由营养生长到生殖生长的过度，从而影响甜瓜的产量和品质[16]。常规的白粉病药物防治既费工、费钱，又或多或少在果实上产生药物残留，不利于食用者的身体健康。采用常规育种与转基因技术、分子标记辅助育种技术有机结合的方法，可以创制和培育出高抗白粉病的甜瓜品种。鞠立君[17]将甜瓜CmLOX09基因导入番茄，发现转基因番茄植株抗白粉病能力增强，并推测CmLOX09通过AOS途径产生的JA相应白粉病的侵染。王磊[18]将葡萄泛素连接酶基因VERH2导入欧洲葡萄无核白和拟南芥中，转基因葡萄和拟南芥对白粉病的抗性均有所提高。王亚军[19]报道，小麦导入TaRGA抗病基因，增强了小麦的白粉病抗性。这些报道均证明导入植物体某种抗病基因，可以提高该转基因植株白粉病的抗性。

几丁质酶基因的表达产物通过降解真菌细胞壁的组成物质几丁质而赋予转基因植株对真菌病的抗性。几丁质酶基因转化研究在玉米[12]、小麦[20]、葡萄[21]、黑麦草[22]等植物上都获得成功，外源基因的表达使得转化植株提高了对白粉病的抗性，这些均与本研究的结论相近，说明几丁质酶基因的导入可以提高植物对白粉病的抗性。此外就转基因食品的安全性问题，1999年，Yutaka[23]报道，导入CMV基因片段的转基因甜瓜，与非转化甜瓜比较，果实的形态，花粉的结构、寿命、萌发与传播大致相同，对田间杂草、土壤微生物群落等的影响也基本一致，证明转基因甜瓜对种植环境无危害；应奇才等[24]设计了转WMV-2CP基因的甜瓜喂饲小鼠的试验，急性毒性、亚急性毒性和致突变试验证明转基因甜瓜不含有急性毒性物质；微核试验和精子畸变试验的结果也证实没有发生基因突变；喂饲转基因甜瓜的小鼠的各项生理特征与对照组并无明显差异。这些均表明转基因甜瓜的食用和环境释放是安全的。