常 琳
郑州大学附属肿瘤医院ICU, 河南省郑州市 450000
前列腺癌是男性泌尿系统常见的恶性肿瘤,在我国的发病率呈逐渐上升趋势,死亡率亦较高[1];但随着生活方式的改变、人口老龄化及肿瘤筛查的普及,前列腺癌在我国的发病率亦呈直线上升,且发现时多已是中晚期,因此其发病机制逐渐引起重视。
谷胱甘肽-S-转移酶作为一种多功能二聚体同工酶家族,具有催化解毒的作用,可将致癌物排出,其包含A、M、T、P四个亚家族,而谷胱甘肽-S-转移酶P1(GSTP1)就是P亚家族中的一员,它在抗肿瘤、抗细胞损伤的过程中发挥着重要作用[2]。有研究表明,GSTP1基因甲基化的异常致使GSTP1基因失去活性,而这种失活对肝癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和前列腺癌等多种肿瘤的发生、发展都起着至关重要的作用。随着研究的逐渐深入,发现DNA甲基化的过程是可逆的,可通过相关手段使DNA去甲基化而恢复表达,成为了肿瘤治疗的新方法[3]。本文旨在探讨三氧化二砷(As2O3)对前列腺癌移植瘤GSTP1基因的甲基化状态的影响及可能相关的机制,为前列腺癌治疗的研究提供新的思路、方向及实验依据。
1.1 材料与试剂 人前列腺癌细胞株DU145于中科院上海细胞库购买;30只Balb/c(nu-/nu-)雄性裸鼠于湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买;动物RNA、DNA提取试剂盒、甲基化修饰试剂盒分别于北京鼎国昌盛、Epigentek公司购买;反转录试剂盒购于Thermo Scientific公司;兔抗GSTP1单克隆抗体、免疫组化SP-0023试剂盒均购于北京博奥森生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及裸鼠模型建立:前列腺癌DU145细胞用PRMI-1640培养液于细胞培养箱(T 37℃,5% CO2)中常规培养;取对数生长期细胞,加胰酶消化液消化成单细胞悬液,注射于接种裸鼠的右前肢靠近腋窝处的背部皮下,1周左右时间接种肿瘤细胞部位开始呈现硬结改变,随时间逐渐长大,即成功建立前列腺癌移植瘤的模型,100%成瘤。
1.2.2 模型的分组、处理:2周后去除瘤体过大或过小的裸鼠,留下大小一致、形状规则的28只裸鼠,随机分为4组,每组7只(剪耳做标记):给药前称重,每组均给药3周。空白对照组:腹腔注射:0.2ml生理盐水+灌胃:0.2ml三蒸水,1次/d;比卡鲁胺组:腹腔注射:0.2ml生理盐水+灌胃:0.2ml比卡鲁胺(23mg/kg),1次/d;As2O3组:腹腔注射:0.2ml As2O3(3mg/kg)+灌胃:0.2ml三蒸水,1次/d;As2O3+比卡鲁胺组:腹腔注射:0.2ml As2O3(3mg/kg)+灌胃:0.2ml比卡鲁胺(23mg/kg),1次/d。用药结束后的第2天脱臼处死裸鼠,并将肿瘤组织完整的解剖处理,称重,并放入液氮中保存,裸鼠尸体由实验动物中心集中处理。
1.2.3 RT-PCR检测:根据总RNA提取试剂盒提供的步骤来提取总RNA ,然后根据反转录试剂盒提供的步骤吸取1μg RNA 反转录为cDNA,取50μl反应体系(2×Taq PCR Green Mix 25μl、cDNA 3μl、引物F 1μl、引物R 1μl、DDH2O 20μl)进行RT-PCR。β-actin 引物序列:F:5’-AGGCATTGTGTGATGGACTCCG-3’;R:5’-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3’,产物大小301bp;GSTP1 引物序列:F:5’-TCCAATACCATCCTGCGTCAC-3’;R:5’-ATCCTTGCCCGCCTCATAG-3’,产物大小156bp;冰上操作,反应条件为:94℃预变性3min、94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s,共35个循环,产物放置4℃保存。取5μl产物,加样于2.0%琼脂凝胶中进行电泳,并观察分析凝胶成像。
1.2.4 MSP检测:据DNA提取试剂盒步骤提取总DNA,取4μg DNA按DNA甲基化修饰试剂盒步骤操作,得到甲基化修饰的DNA;50μl反应体系(2×Taq Master Mix 25μl、DNA 模板1μl、引物F 2μl、引物R 2μl、DDH2O 20μl)中进行MSP;uGSTP1引物序列:F:5’-GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT-3’;R:5’-CCACCCCAATACTAAATCACAACA-3’,产物大小97bp;mGSTP1 引物序列:F:5’-TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC-3’;R:5’-GCCCCAATACTAAATCACGACG-3’,产物大小93bp。冰上操作,反应条件为:94℃预变性2min、94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s,共35个循环,72℃终延伸2min,产物于4℃保存。取5μl产物,同样于2.0%琼脂凝胶中进行电泳,观察分析凝胶成像。
1.2.5 免疫组化检测:按免疫组织试剂盒提供的步骤进行操作,检测四组移植瘤组织GSTP1蛋白质的表达情况。
1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行数据处理,统计学差异的比较采用方差分析,α=0.05为显著性检验水准。以P<α为差异有统计学意义。
2.1 As2O3诱导GSTP1 mRNA 的重新表达 空白对照组和比卡鲁胺组无目的基因条带出现,而As2O3组和As2O3+比卡鲁胺组均出现相应的目的条带(156bp);分析两组基因条带的灰度值(采用Image J软件系统):As2O3组为:0.852;As2O3+比卡鲁胺组为:0.834;两组条带灰度差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。
图1 As2O3对四组标本mRNA的作用
1-空白对照组;2-比卡鲁胺组;3-As2O3组;4-As2O3+比卡鲁胺组
2.2 As2O3对GSTP1 DNA 的去甲基化作用 GSTP1甲基化阳性条带为93bp,去甲基化阳性条带为97bp,空白对照组和比卡鲁胺组出现明显的甲基化阳性条带,未出现明显的去甲基化阳性条带;而As2O3组和As2O3+比卡鲁胺组均出现明显的去甲基化阳性条带;分析两组去甲基化条带的灰度值(采用Image J软件系统):As2O3组为:0.685;As2O3+比卡鲁胺组为:0.702;两组的去甲基化条带灰度差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。
图2 As2O3对四组标本DNA的去甲基化作用
m-甲基化条带,u-去甲基化条带;1-空白对照组;2-比卡鲁胺组;3-As3O2组;4-As3O2+比卡鲁胺组
2.3 As2O3诱导GSTP1蛋白的重新表达 400倍显微镜下,随机选择每张玻片的5个视野进行观察,每个视野中随机选择出100个细胞:阳性细胞判定标准为胞核或胞浆中染色出棕黄色颗粒;通过评分半定量分析法来判定组织阳性程度,即将阳性细胞的百分数计分×染色强度的计分=蛋白的相对表达量。其中,阳性细胞的百分数计分标准为:0分:阳性细胞百分比<10%;1分:阳性细胞百分比11%~25%;2分:阳性细胞百分比26%~50%;3分:阳性细胞百分比51%~75%;4分:阳性细胞百分比>75%。染色强度的计分标准为:0分:无色,1分:淡黄色,2分:棕黄色,3分:棕褐色。蛋白相对表达量总分:强阳性(+++):9~12分;中等阳性(++):5~8分;弱阳性(+):2~4分,阴性(-):0~1分。实验结果为:空白对照和比卡鲁胺组均为阴性(0分),As2O3组和As2O3+比卡鲁胺组均为阳性(9分)。见图3。
DNA甲基化是研究相对清楚的一种表观遗传学修饰机制,而DNA的异常甲基化可导致恶性肿瘤的发生,其主要机制可能为其激活或抑制了细胞周期、细胞生长及细胞凋亡相关的基因。DNA的异常甲基化可成为监控恶性肿瘤生长的潜在生物标志物,多种研究中已证实其与基因损失修复、调控细胞周期、激素相关反映、肿瘤的发生发展、浸润转移等多个方面密切相关[4-6]。有研究发现在前列腺癌中,DNA CpG岛甲基化导致了启动子的失活及基因沉默,如COX-2、ER、MDR1、hMLH1等的甲基化[7-10]。在前列腺癌中,很多基因功能丧失的主要或者唯一的机制可能就是DNA异常甲基化[11]。GSTP1作为一种解毒酶,是谷胱甘肽-S-转移酶家族中的重要成员,它在抗细胞损伤、抗肿瘤方面具有极其重要的作用。它的异常甲基化可导致GSTP1基因的失活,各种致瘤因素因此更容易攻击前列腺中正常的上皮细胞,使其癌变,同时肿瘤细胞亦会受到某些因素的攻击,导致进一步恶性进展[12]。同时研究表明,DNA甲基化这种表观遗传学事件具有可逆性,此特性使其成为药物治疗新的研究方向,以期通过某些药物作用不同程度的减少甚至消除DNA异常甲基化,从而来治疗恶性肿瘤。
图3 As2O3对四组标本蛋白质表达的作用
A:空白对照组(×400倍),B:比卡鲁胺组(×400倍),C:As2O3组(×400倍),D:As2O3+比卡鲁胺组(×400倍)
As2O3抗肿瘤的作用涉及多方面,随着研究的不断深入,其中在DNA去甲基化方面具有良好的应用前景。本实验建立裸鼠前列腺癌移植瘤模型,分别采用RT-PCR、免疫组化法检测四组瘤组织标本中GSTP1 mRNA和蛋白质的表达情况,采用MSP观察As2O3对GSTP1基因的去甲基化作用。本研究中,空白对照和比卡鲁胺两组的GSTP1 mRNA、蛋白质表达均为阴性,且对GSTP1 基因未表现出明显的去甲基化作用,而As2O3和As2O3+比卡鲁胺两组的GSTP1 mRNA、蛋白质表达均为阳性,且两组表达的mRNA阳性条带灰度值差异无统计学意义(P>0.05);同时对GSTP1基因均表现出明显的去甲基化作用,且两组去甲基化阳性条带灰度值差异无统计学意义(P>0.05);表明发挥去甲基化作用的药物为As2O3,比卡鲁胺组未出现目的条带说明其无DNA去甲基化作用。从而得出结论:一定剂量的As2O3具有逆转前列腺癌移植瘤GSTP1 DNA甲基化状态的作用,并能诱导GSTP1 mRAN和蛋白质的重新表达;为前列腺癌的治疗提供了新的方向和实验理论依据。本实验仅是As2O3去甲基化作用研究的一部分,其具体作用机制和临床应用仍有待进一步深入的研究。