广西发酵酸笋气味物质提取方法优化及比较分析

郭荣灿,王成华,江虹锐,余 炼,刘小玲,*,赵谋明,2,*

(1.广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530004; 2.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510641)

竹笋是一种传统食材,被广泛应用于我国、印度及东南亚国家的菜肴烹煮中[1-3]。发酵竹笋是针对鲜竹笋储藏困难的问题而诞生的自然发酵产物。在广西,发酵酸笋是重要的食物原料。酸笋一个重要的特征就是其发酵酸味,该气味具有很强的地区嗜好性,对其推广产生了阻碍。对酸笋气味组成进行研究,有利于对发酵酸笋进行性能改良、品质控制以及按嗜好进行市场细分,对推广地区特色产品有很大的意义。

随着检测仪器和技术的不断进步,气味成分的提取浓缩技术也在不断丰富。常见的气味物质提取方法有液液萃取法(LLE)、同时蒸馏萃取法(SDE)、顶空固相微萃取法(HS-SPME)等。LLE操作简单,但是耗时长,该方法也用于非挥发性物质的提取[4],可能会引入非挥发性化合物,从而干扰实验结果。SDE法是通过同时加热样品及萃取溶剂,使挥发组分与溶剂蒸气混合,从而达到萃取的目的,该方法对含量低的挥发成分萃取效果较好,但需要保持沸腾,很容易造成气味物质的变化[5]。顶空固相微萃取法不需要高温加热,实验装置简单,但萃取物质类型易受到萃取头涂层种类的影响[6]。目前,对广西发酵酸笋气味的研究匮乏,提取方法各有优劣,用何种方法提取气味物质效果最好尚无研究结论。本文使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分别对LLE、SDE、HS-SPME法提取的发酵酸笋气味物质的萃取峰面积和萃取物质种类进行优化和比较,旨在寻找最优的气味物质提取方法,为进一步展开深入的风味研究提供方法支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

发酵酸笋样品及其发酵液 广西南宁市五里亭菜市场;氯化钠 国药集团化学试剂有限公司;二氯甲烷、正己烷 天津富宇精细化工有限公司、乙醚 江苏沭阳恒润精细化工有限公司;以上试剂 均为分析纯。

7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪、DB-Wax弹性石英毛细管色谱柱 美国Agilent公司;Milli-Q水净化系统 德国Merck公司;75 μm CAR/PDMS固相微萃取头、85 μm PA固相微萃取头、100 μm PDMS固相微萃取头、65 μm PDMS/DVB固相微萃取头、手动固相微萃取握柄 美国Supelco公司;HY-5A回旋式振荡摇床 常州朗越仪器制造有限公司;JYL-C16V食品研磨机 山东九阳股份有限公司;RCT B S025数显恒温磁力搅拌装置、T25 digital均质机 美国IKA公司;LG10-2.4A离心机 北京京立离心机有限公司;5418 R高速离心机 德国Eppendorf公司;DZTW调温加热套 北京市永光明医疗仪器有限公司;AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 LLE法提取发酵酸笋香气物质及条件优化

1.2.1.1 香气物质的提取 参考冯云子[7]的LLE条件,设计实验如下:将50 g酸笋通过食品研磨机粉碎成糊,与50 mL发酵酸液混合后,置于1000 mL锥形瓶中。加入100 mL盐水与100 mL萃取剂,在振荡摇床上振荡20 h后,通过分液漏斗取有机层,置于500 mL锥形瓶中。加入适量无水硫酸钠除水,用保鲜膜封口后,于振荡摇床上振荡1 h,之后通过滤纸过滤。使用注射器将1 mL滤液通过0.22 μm有机相膜过滤到GC-MS进样瓶(2 mL)中,进行GC-MS分析。

1.2.1.2 萃取溶剂的选择 由于溶剂对萃取效果有一定的影响,故分别采用二氯甲烷(极性)、乙醚(极性)、正己烷(非极性)按照初始条件,添加17.00%氯化钠溶液,对萃取峰面积及萃取物质种类进行对比。

1.2.1.3 样品离子浓度的优化 适量的氯化钠溶解在水中会增加样品的离子浓度,从而降低挥发性化合物在水中的溶解度,促进其向有机相溶剂的传质过程。以初始条件为基础,使用最佳溶剂作为溶剂,分别添加0.00%、17.00%、饱和氯化钠溶液,对比萃取峰面积及萃取物质种类。

1.2.2 SDE法提取发酵酸笋香气物质及条件优化

1.2.2.1 香气物质的提取 参考冯云子[7]的SDE条件,设计实验如下:将50 g酸笋通过食品研磨机粉碎成糊,与50 mL发酵酸液混合后置于 500 mL圆底烧瓶中,加入一定量的氯化钠溶液稀释样品,连接在同时蒸馏萃取装置上,通过加热套加热并保持微沸。另在250 mL圆底烧瓶中添加100 mL萃取溶剂,连接在同时蒸馏装置上后,通过恒温水浴锅保持溶剂微沸。连续提取一定时间后,冷却至室温,取有机相部分置于500 mL锥形瓶中。加入适量无水硫酸钠,用保鲜膜封口后于振荡摇床上振荡1 h,之后通过滤纸过滤。使用注射器将1 mL滤液通过0.22 μm有机相膜过滤到GC-MS进样瓶(2 mL)中,进行GC-MS分析。

1.2.2.2 萃取溶剂的选择 在初始条件的基础上,使用100 mL 17.00%氯化钠溶液稀释样品后,分别使用二氯甲烷(水浴温度45 ℃)、乙醚(水浴温度40 ℃)、正己烷(水浴温度75 ℃)作为萃取溶剂,萃取时间为2 h,对比萃取峰面积及萃取物质种类。

1.2.2.3 样品离子浓度的优化 以初始条件为基础,分别添加100 mL的0.00%、17.00%、饱和氯化钠溶液稀释样品,使用最佳溶剂作为萃取剂,萃取时间为2 h,对比萃取峰面积及萃取物质种类。

1.2.2.4 稀释液添加量的优化 由于同时蒸馏萃取法涉及样品的加热,如不对样品进行稀释,加热过程中可能会造成样品焦糊,影响萃取效果,故在初始条件的基础上,分别添加50、100、150及200 mL的最佳浓度氯化钠溶液,使用最佳溶剂作为萃取剂,萃取时间为2 h,对比萃取峰面积及萃取物质种类。

1.2.2.5 萃取时间的优化 在以上条件均选取最佳萃取条件后,分别对比萃取1、2、3及4 h的萃取峰面积及萃取物质种类。

1.2.3 HS-SPME萃取法提取发酵酸笋香气物质及条件优化

1.2.3.1 香气物质的提取 参考Kim等[8]的HS-SPME实验条件,实验设计如下:样品前处理:将100 g发酵酸笋固体经食品研磨机粉碎后与100 mL发酵酸液混合,在冰水浴下通过均质机以8000 r/min均质1 min。匀浆放入离心管中,以5000 r/min离心15 min后取上清液,再经10000 r/min离心30 min,放入样品瓶中备用。

萃取:取样液3 mL放入15 mL顶空样品瓶,与等体积超纯水混合,加入氯化钠和磁力转子,于300 r/min转速下磁力搅拌,水浴平衡30 min,分别使用经过老化的萃取头萃取一定时间后,通过手动进样口进样,在250 ℃下释放5 min,通过GC-MS测定结果。

1.2.3.2 萃取针头的选择 本实验筛选了四种具有不同固定相涂层的萃取头,分别为85 μm PA(Polyacrylate,聚丙烯酸酯,强极性)、75 μm CAR/PDMS(Carboxen/Polydimethylsiloxane,碳分子筛/聚二甲硅氧烷,中极性)、65 μm PDMS/DVB(Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene,聚二甲硅氧烷/二乙烯基苯,中极性)、100 μm PDMS(Polydimethylsiloxane,聚二甲硅氧烷,非极性),在样品中加入0.60 g氯化钠,于50 ℃下萃取30 min。萃取头使用一台气相色谱柱进样口作为老化装置,使用氮气吹扫保持环境惰性,老化时间及温度按照Supelco公司的推荐条件进行,具体见表1。

表1 固相微萃取头的老化温度和时间Table 1 Aging temperature and time for SPME fiber

1.2.3.3 样品离子浓度的优化 使用最佳萃取头,在样品中分别加入相当于样品质量0%(0.00 g)、1%(0.60 g)、2%(1.20 g)、3%(1.80 g)氯化钠,于50 ℃下萃取30 min。对比萃取峰面积及萃取物质种类。

1.2.3.4 萃取温度的优化 使用最佳萃取头,在样品中加入最佳添加量的氯化钠,分别于30、40、50、60 ℃下萃取30 min,对比萃取峰面积及萃取物质种类。

1.2.3.5 萃取时间的优化 在上述最佳条件下分别萃取10、20、30、40 min,对比萃取峰面积及萃取物质种类。

1.2.4 挥发性成分的GC-MS测定 GC条件:色谱柱使用DB-Wax(60 m×0.25 mm×0.25 μm),进样器温度250 ℃,LLE及SDE法样品通过自动进样器进样1 μL,溶剂延迟8 min;HS-SPME法为手动进样,解吸时间为5 min。柱箱升温程序:40 ℃保持2 min,以5 ℃/min的速度上升到120 ℃,保持2 min,再以7 ℃/min的速度上升到220 ℃,保持5 min,最后以7 ℃/min的速度上升到240 ℃,保持5 min。

MS条件:质谱条件为传输线温度250 ℃。离子能级70 ev,采用SCAN(全扫描)模式,扫描质荷比范围为35～395。LLE及SDE法样品设置3 min的溶剂延迟。

定性与定量方法:色谱图通过MassHuter软件积分并与NIST14谱库比对,取匹配度在80%以上的物质进行分析。通过积分法计算绝对峰面积,并通过峰面积归一化法计算相对含量。

1.3 数据处理

本文实验进行两次平行实验,峰面积数据以平均值形式表示,提取物质总数数据取平行组中最大值,相对含量以百分比形式呈现。数据通过SPSS软件进行统计计算,总离子流图通过Origin软件进行绘制。

2 结果与讨论

2.1 LLE法的萃取效果及条件优化

2.1.1 不同溶剂对LLE萃取酸笋挥发性物质效果的影响 正己烷、乙醚和二氯甲烷3种不同极性溶剂在LLE法中对酸笋中挥发性成分的萃取效果如表2所示。由表2可知,不同溶剂萃取酸笋挥发性物质的总峰面积由大到小分别为:乙醚>正己烷>二氯甲烷。而萃取物质种类由多至少分别为:乙醚>二氯甲烷>正己烷。非极性溶剂正己烷的萃取总峰面积虽较极性溶剂二氯甲烷大,但其萃取的物质种类少于两种极性溶剂,推测与相似相溶原理有关,在酱油的香味成分萃取上也存在香味物质以极性物质为主的情况[7]。故考虑到萃取物质的多样性,正己烷并不适合作为发酵酸笋气味物质的萃取溶剂使用。而在极性溶剂方面,极性较强的乙醚无论是萃取总峰面积还是物质总类优于二氯甲烷。综上所述,乙醚是通过液液萃取法萃取酸笋挥发性气味成分的最佳溶剂。

表2 不同溶剂对LLE萃取酸笋挥发性物质效果的影响Table 2 Effect of different solvents on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by LLE

2.1.2 不同样品离子浓度对LLE萃取酸笋挥发性物质效果的影响 向样品中添加0.00%、17.00%和饱和氯化钠溶液在LLE法中对酸笋中挥发性成分的萃取效果如表3所示。从表3可以看出,随着氯化钠溶液浓度由增加0%增加至饱和,萃取总峰面积由4.22×109Ab·s逐渐增加至6.76×109Ab·s,而提取物质总数也由29增加至34种。这与增加离子强度会抑制挥发性物质在水相中的溶解度的理论符合[9],故采取添加饱和氯化钠溶液作为最佳离子浓度条件。

表3 不同离子浓度对LLE萃取 酸笋挥发性物质效果的影响Table 3 Effect of different salt concertrations on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by LLE

2.2 SDE法的萃取效果及条件优化

2.2.1 不同溶剂对SDE萃取酸笋挥发性物质效果的影响 正己烷、乙醚和二氯甲烷3种不同极性溶剂在SDE法中对酸笋中挥发性成分的萃取效果如表4所示。由表4可知,不同溶剂萃取酸笋挥发性物质的总峰面积由大到小分别为:二氯甲烷>乙醚>正己烷。而萃取物质种类由多至少分别为:二氯甲烷>乙醚>正己烷。极性溶剂正己烷萃取在总峰面积和物质种类方面均劣于非极性溶剂,故非极性溶剂正己烷并不适合作为SDE法萃取发酵酸笋气味物质的萃取溶剂。在极性萃取溶剂方面,乙醚的萃取物质总峰面积(6.64×108Ab·s)和萃取的物质种类(19种)均少于二氯甲烷(1.09×109Ab·s,22种)。推测原因为SDE法中的萃取过程为将样品与溶剂同时加热,挥发性成分在通过加热后以气态形式与溶剂蒸气混合,故最终萃取液中不包含难挥发性组分,而在LLE过程中则由于样品与萃取液的直接接触,造成了难挥发性成分能够从水相转移至有机相,LLE中萃取的物质种类普遍多于SDE的原因也可以解释为此。因此在SDE法萃取实验中,二氯甲烷的萃取效果优于乙醚,这与通过SDE法萃取豆瓣酱和东方鲀的气味物质的实验结果一致[10-11]。综上所述,二氯甲烷是通过同时蒸馏萃取法萃取酸笋挥发性气味成分的最佳溶剂。

表4 不同有机溶剂对SDE萃取 酸笋挥发性物质效果的影响Table 4 Effect of different organic solvents on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by SDE

2.2.2 不同样品离子浓度对SDE萃取酸笋挥发性物质效果的影响 向样品中添加0.00%、17.00%和饱和氯化钠溶液在SDE法中对酸笋中挥发性成分的萃取效果如表5所示。从表5可以看出,与LLE实验中盐含量变化引起萃取效果变化的规律类似,随着氯化钠溶液浓度的增加,无论是物质种类还是物质总质量均在上升,在饱和食盐水中达到最佳(1.62×109Ab·s,24种),故采取添加饱和氯化钠溶液作为最佳离子浓度条件。

表5 不同离子浓度对SDE萃取 酸笋挥发性物质效果的影响Table 5 Effect of different salt concertrations on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by SDE

2.2.3 不同稀释液添加量对SDE萃取酸笋挥发性物质效果的影响 向样品里添加50、100、150、200 mL的饱和氯化钠溶液,对萃取效果的影响如表6所示。从表6可以看出,当添加的稀释液体积为50 mL时,其萃取的物质总数为23种,仅比最多的100 mL组少1种,且萃取的物质总质量(以总峰面积表示)最高(1.95×109Ab·s)。由于SDE法的样品涉及保持沸腾状态的加热过程,如不添加一定量的稀释液稀释样品,会造成样品焦糊。在实验过程中,50 mL组在萃取后期出现焦糊现象,萃取样品也散发着焦糊气味,故其总峰面积大可能是由于稀释不足,发生焦糊现象时产生了新的不良气味物质引起的,因此该稀释液添加量不适合进行SDE萃取。在未发生焦糊现象的组(100～200 mL)中,随着饱和氯化钠溶液添加量的增加,萃取物质的总峰面积在从1.61×109Ab·s逐渐下降到9.26×108Ab·s,萃取的物质总数也从24种减少到22种,这说明当加入150 mL或更多饱和氯化钠溶液后,稀释液体积过大造成样品被过分稀释,影响了萃取效果。综上所述,100 mL为SDE法最适氯化钠溶液添加量。

表6 不同稀释液添加量对SDE萃取 酸笋挥发性物质效果的影响Table 6 Effect of different volumes of diluent on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by SDE

2.2.4 不同样品萃取时间对SDE萃取酸笋挥发性物质效果的影响 对样品进行1、2、3、4 h的提取,萃取效果如表7所示。从表7中可以看出,萃取时间为1 h的样品萃取物质总峰面积及提取出的物质总数均最少(7.47×108Ab·s,20种),说明1 h的萃取时间明显不足,挥发性物质与溶剂蒸气混合时间短,难以完全萃取挥发性成分。理论上同时蒸馏萃取过程由于萃取液蒸气和水蒸气的冷却回流,萃取液和样品水溶液的总量在装置中维持不变,提取过程是无损失的循环过程,故延长提取时间可以增加挥发性物质和萃取剂蒸气的混合次数,从而增加提取效果[12],但在实际实验中由于密封条件无法完全达到理论状态,水蒸气和萃取溶剂蒸气会少量泄露,经过长时间的实验有可能造成样品焦糊或有机萃取溶剂不足的状态,且长时间的加热过程可能会破坏挥发性气味物质。在萃取时间超过2 h的情况下,随着时间的增加,总峰面积保持在1.62×109Ab·s左右,2～3 h提取物质总数的变化并不明显(24种),在加热4 h的时候提取出的物质总数还减少了1种。故可以看出,提取2 h已经可以较为充分地提取出酸笋样品中的挥发性成分,故最佳萃取时间选择为2 h。

表7 不同萃取时间对SDE萃取 酸笋挥发性物质效果的影响Table 7 Effect of different extraction time on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by SDE

2.3 HS-SPME法的萃取效果与条件优化

2.3.1 不同萃取头对HS-SPME萃取酸笋挥发性物质效果的影响 四种不同涂层的萃取头进行实验,对比萃取效果,结果如表8所示。由表8可以看出,强极性萃取头PA总峰面积较高,中极性萃取头PDMS/DVB和CAR/PDMS的萃取总峰面积次之,非极性萃取头PDMS萃取总峰面积最低。从萃取的物质总数来说,PDMS/DVB的萃取效果最好(39种),较PA萃取头多了11种,从萃取效果完整性方面考虑,选择65 μm PDMS/DVB为最佳萃取头。

表8 不同萃取头对HS-SPME萃取 酸笋挥发性物质效果的影响Table 8 Effect of different SPME fibers on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by HS-SPME

2.3.2 不同样品离子浓度对HS-SPME萃取酸笋挥发性物质效果的影响 由于向水相溶液中添加盐离子,可以通过增加离子强度,降低疏水性化合物在水中的溶解度,促进其析出,故在HS-SPME实验中通常都会添加一定量的氯化钠以增加萃取效果[13]。本实验中研究了向样品中分别加入相当于样品质量0%(0.00 g)、1%(0.60 g)、2%(1.20 g)、3%(1.80 g)氯化钠对萃取效果的影响。由表9可知,在添加氯化钠量为0.00～1.20 g之间时,随着添加氯化钠质量的上升,总峰面积由1.88×109Ab·s上升至3.21×109Ab·s,萃取的物质总数也由38种上升至41种,而在将氯化钠添加量增加至1.80 g时,萃取效果(3.21×109Ab·s,41种)与1.20 g时(3.23×109Ab·s,41种)相差不大。故可知在添加氯化钠质量为1.20 g时,已经达到了将酸笋中的挥发性物质通过HS-SPME萃取出来的萃取效果。根据在酱油方面的对HS-SPME与盐浓度的研究[7],当氯化钠浓度上升到一定浓度,会对部分挥发性物质,特别是小分子挥发性物质产生抑制作用,如继续增加氯化钠浓度有降低萃取效果的可能,故在此选择1.20 g作为最佳氯化钠添加量。

表9 不同离子浓度对SPME萃取 酸笋挥发性物质效果的影响Table 9 Effect of different salt concertrations on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by HS-SPME

2.3.3 不同萃取温度对HS-SPME萃取酸笋挥发性物质效果的影响 本实验分别在30、40、50及60 ℃进行萃取,对比萃取效果,结果如表10所示。由表10所示,萃取温度由30 ℃上升到50 ℃之间时,萃取总峰面积由2.23×109Ab·s上升至3.20×109Ab·s,提取出的物质总数由34种上升至41种。但当萃取温度上升到60 ℃时(3.22×109Ab·s,41种),萃取效果相较于50 ℃时(3.20×109Ab·s,41种)没有明显的变化。HS-SPME通过加热使样品中的挥发性物质析出,分散在样品上方的空气中,再通过萃取头吸附挥发性物质,在这个过程中,萃取温度的提高对挥发性物质的析出有加速作用,且部分挥发性物质必需达到一定的温度才能充分挥发,故过低的温度会降低萃取效果,而过高的温度会造成顶空部分水蒸气含量过高,加速萃取头使用寿命的损耗。故可以得知,在进行HS-SPME萃取时,萃取温度达到50 ℃时,已经足以对发酵酸笋的挥发性组分进行充分的萃取。

表10 不同萃取温度对HS-SPME 萃取酸笋挥发性物质效果的影响Table 10 Effect of different extraction temperatures on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by HS-SPME

2.3.4 不同萃取时间对HS-SPME萃取酸笋挥发性物质效果的影响 在本实验中在采取上述实验选取出的最佳条件下,分别对样品分别萃取10、20、30、40 min,对比萃取效果,结果如表11所示。灌服狭果茶藨子果实乙酸乙酯萃取物Ⅱ低、中剂量由表11可知,随着温度提取时间的增加,在30 min时提取物质的总峰面积达到3.21×109Ab·s,提取出的物质总数为41种,再继续增加提取时间至40 min,提取物质总峰面积为3.23×109Ab·s,相较30 min时增加并不多,而物质种类没有增加,说明提取时间为30 min已充分提取挥发性物质。

表11 不同萃取时间对HS-SPME 萃取酸笋挥发性物质效果的影响Table 11 Effect of different extraction time on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by HS-SPME

足够的萃取时间可以让固相微萃取头与顶部空气进行充分传质,直到达到动态平衡则萃取完全,故一定的萃取时间是必要的。但由于用于萃取的样品酸笋液水分含量较高,萃取过程中会产生大量水蒸气,长时间令萃取头暴露在有水蒸气的环境中,会加速萃取头使用寿命的损耗,故萃取时间在萃取充分的条件下也应该尽量缩短。故选择30 min作为最佳提取时间。

2.4 不同提取方法对酸笋挥发性风味物质提取效果的比较分析

由2.1～2.3中的结论,分别采用LLE、SDE及HS-SPME的最佳条件进行萃取实验。3种萃取方法的萃取物质详表如表12,总离子流图如图1。

表12 不同提取方法酸笋挥发性风味物质的结果比较Table 12 The comparison results of volatile compounds from fermented bamboo shoots by different extraction methods

续表

续表

由表12可知,萃取物质峰面积最大为LLE法,HS-SPME法次之,最后是SDE法,萃取物质种类由多到少顺序则为HS-SPME法、LLE法、SDE法。无论是萃取物质峰面积还是萃取物质种类,均为SDE法效果最不理想。

相较于其他两法,通过LLE法萃取的物质中,杂环类化合物相对含量最高(29.28%),一些杂环物质具有气味活性如吡嗪、呋喃,但在本实验LLE法萃取出的杂环化合物中,含量最高的为2-甲基苯并[e]茚、1,2-二氢-10-甲基-蒽、1,6,7-三甲基-萘等高沸点的化合物,挥发性较差,对气味物质贡献有限。烷烃类化合物种类较多(18种),占到了其萃取物质总数(34种)的一半以上,而该种物质的相对含量为第二,占到了28.50%,其中含有大量高碳数的烷烃,沸点较高。根据酒类、发酵乳制品、发酵调味品及发酵泡菜等其他发酵食品气味的研究[14-17],烷烃类化合物由于大多数沸点较高或嗅闻阈值较高,在食品当中难以觉察,对气味贡献较小。而醇(1种)、酚(2种)、酸(3种)、烯(2种)等物质种类较少,这几类物质的相对含量均小于以上两种物质,相对含量之和为42%,而该类物质则通常作为对呈味起贡献作用的物质存在[14-17]。这可能是由于LLE法引入了过多的非挥发性物质,故在GC-MS分离鉴定过程中掩盖了含量较少的挥发性气味物质。而另外两法在原理上通过萃取以气态形式存在的挥发性物质,没有直接与样品接触,没有出现这一问题。

SDE法萃取出的物质中相对含量最高的为酚类(35.71%)、醇类次之(23.44%),再到酸类(17.85%)和酯类(16.04%),合计达到93.04%。同上文所述,这几类物质常被认为对气味贡献较大。在SDE萃取的这几类物质中,含量较高的对甲酚、乙酸、3-呋喃甲醇等均是常见被报道的呈味物质。

HS-SPME法萃取物质峰面积相对较大,萃取出的物质种类最为丰富,且其中有着起气味贡献作用潜力的醇(5种)、酚(6种)、酸(5种)、烯(6种)、酯(6种)类物质较多,相对含量由多至少依次为酚(68.13%)、酸(15.03%)、醇(14.22%)及其他,前3类物质的相对含量达到了97.38%,其中含量较高的对甲酚、苯酚、乙酸、乙醇均是发酵食品中常见的气味物质[14-17]。

可见对于挥发性物质的萃取效果上,LLE法虽然获取的峰面积最大,但其萃取出的物质中气味贡献度较低的高沸点杂环类和烷烃类所占比例较高,而SDE法和HS-SPME法萃取物质种类则更多地集中在气味贡献度较高的强挥发性低沸点物质上。

对比图1可以明显看出,自25 min开始直至结束,LLE对应的总离子流色谱图(图1A)上出现较多杂峰,该现象并未在另外两组色谱图(图1B、C)中出现,同时LLE萃取的萃取液相较于SDE萃取得到的样液颜色偏黄,故认为在萃取过程中由于LLE法为萃取液与样品液直接接触,除含量偏少的挥发性气味物质外,LLE法也将诸如色素等含量更高的非挥发性有机物萃取了出来,引起了杂峰偏多现象,这与前文中LLE法萃取物质中非气味贡献物质种类较多的情况相对应。这些杂峰的引入会掩盖目标物质在色谱图中的分离效果,同时也降低了质谱系统的鉴定精确度,这也就能解释为何通过LLE法获得的总峰面积最大,但通过质谱鉴定准确度高于80%的物质数低于HS-SPME法。

图1 LLE、SDE及HS-SPME法 提取酸笋气味物质总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of fermented bamboo shoots volatiles obtained by LLE,SDE and HS-SPME注:A图为LLE法总离子流图;B图为SDE法总离子流图; C图为HS-SPME法总离子流图。

综上所述,LLE法萃取物质种类多,总峰面积最大,但对气味起贡献作用的物质相对含量偏低;SDE法萃取的物质中对气味起贡献作用的物质相对含量较高,但其萃取物质种类和总峰面积均在三法中最低;HS-SPME法萃取物质种类最多,总峰面积大,且萃取物质种类集中在对气味起贡献作用的物质上,故认为HS-SPME法是萃取发酵酸笋气味物质的最佳方法。

3 结论

本研究主要优化了LLE、SDE、HS-SPME法在萃取发酵酸笋气味物质方面的最佳萃取条件,并通过对比3种方法的萃取效果,选择最佳的萃取发酵酸笋气味物质的方法,结论如下:LLE法使用乙醚作为提取溶剂,稀释液使用饱和氯化钠溶液提取效果最佳。SDE法采用二氯甲烷作为提取溶剂,稀释液采用100 mL饱和氯化钠溶液,提取2 h效果最佳。HS-SPME法采用65 μm PDMS/DVB萃取头,添加1.2 g氯化钠,在50 ℃下水浴萃取30 min萃取效果最佳。各萃取法使用以上条件,可使得萃取峰面积及萃取物质种类达到最大。对比3种萃取方法,由于LLE法直接接触样品液,传质效果好,萃取物质峰面积最大(5.16×109Ab·s),且萃取物质种类多(34种),但其中对气味贡献作用低的高沸点杂环类和烷烃类物质所占比重较大(相对含量达到57.78%);而SDE法萃取物质集中在对气味贡献度较高的酚、醇、酸、酯类物质上(相对含量达到93.04%),但其峰面积最小(1.61×109Ab·s),萃取物质种类最少(24种);HS-SPME对挥发性成分的萃取峰面积较高(3.20×109Ab·s),同时该法萃取的物质种类最为丰富(41种),且其中酚、酸、醇类物质相对含量高(97.38%),故HS-SPME法为萃取发酵酸笋气味物质的最佳方法。