脂肪酶在海参内脏多肽气味与口感可接受性优化中的应用

毛 毛,侯 虎,郭 红,衣美艳

(1.山东东方海洋科技股份有限公司,国家海水鱼类加工技术研发中心分中心,山东烟台 264003; 2.中国海洋大学,山东青岛 266003)

由海参肠壁、呼吸树与海参性腺等组成的海参内脏是鲜活海参加工的主要废弃物。研究表明海参多肽具有抗氧化、降血压等生物活性[1-3]。海参内脏除蛋白质外,富含多糖、皂苷、磷脂、多酚类、黄酮类等活性物质[4-5]。海参性腺风味独特,中国少数沿海地区与日本等国家与地区将其作为昂贵滋补品;而肠脏等内脏由于气味特殊、口感苦麻刺激,难以加工利用[6]。海参内脏多肽是目前市场上主要的海参内脏功能性制品,感官接受度普遍较差,影响其进一步加工应用。为提高海参内脏肽的感官接受度,通常采取对原料进行漂洗或热处理的方式来脱除不良气味与口感,然而这样的处理方式易造成水溶性成分的大量损失,且感官优化效果有限。

脂肪酶是一种广泛存在于植物、动物和微生物中的生物催化剂,其天然作用底物为三脂酰甘油酯,能水解酯键,生成游离脂肪酸;能够催化酯化、酯交换及转酯化反应,已广泛应用于食品、医药、洗涤剂等行业[7-8]。目前在食品工业中,脂肪酶主要应用于油脂改性、奶制品与肉制品的风味促进、烘焙制品的质地改善等[9-11]。以棕榈油为底物,经脂肪酶催化与硬脂酸甲酯交酯化作用可合成类可可脂[9]。封莉等[10]证实添加脂肪酶能有效加速中式香肠中的脂肪降解和脂肪氧化,促进香肠中脂质来源的挥发性风味物质的生成。脂肪酶在水产品加工领域的应用较少,仅局限于作为脱脂剂。海参内脏中含有一定量的脂质,且成分复杂,本研究拟将脂肪酶应用于海参内脏多肽的制备中,探讨脂肪酶对于海参内脏多肽感官性质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山东莱州产春季刺参内脏 山东东方海洋科技股份有限公司;脂肪酶(1×105U/mL) 南宁庞博生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(2×105U/mL) 南宁庞博生物工程有限公司;胶原蛋白酶(2×105U/mL) 丹麦诺维信公司(苏州)。

HH4恒温水浴锅 金坛天瑞公司;CS-10离心机 盐城凯特实验仪器有限公司;色差仪 杭州彩谱科技有限公司;BY-2000喷雾干燥机 上海秉越公司;JRJ300-SH组织破碎机 上海标本模型厂。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 解冻→组织破碎→一次酶解→二次酶解→灭酶→离心→层析脱盐→喷雾干燥。

1.2.2 海参内脏多肽制备 海参内脏多肽的制备方法参照曹荣等[12]的方法,并为适应脂肪酶的添加进行适当调整。将去除生殖腺的海参内脏于15 ℃解冻4 h,转速7000 r/min破碎30 s备用。将破碎后的组织进行第一次酶解,料液比1∶4 (w∶w),添加木瓜蛋白酶质量分数为0.10%,胶原蛋白酶质量分数为0.05%,在pH6.8条件下50 ℃作用2 h,不灭酶。进行第二次酶解,加一定量脂肪酶,对温度进行调整,在一定的温度下酶解一定时间,过程中持续搅拌。酶解结束后升温至95 ℃15 min进行灭酶处理。将酶解液5000 r/min 25 ℃离心15 min,取上清。对上清液进行层析脱盐。将经过脱盐的液体旋转蒸发浓缩至原体积1/4后进行喷雾干燥,进风温度180 ℃,出风温度90 ℃,进样量20 mL/min。

1.2.3 感官评定方法 将所得喷雾干燥粉末配制成1%的溶液,随机选取20名非专业技术人员组成评价小组,男女各10人,年龄25～40岁,以0.5分为评分区间,分别对溶液的气味与口感进行评价并打分,计算平均分,取两位有效数字。评定标准见表1。

表1 感官评定标准Table 1 The standard of sensory evaluation

1.2.4 单因素实验 固定第二次酶解温度为40 ℃,酶解时间为2 h,将脂肪酶用量设置为质量分数分别为0.00%、0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.16%,对脂肪酶用量进行单因素实验;固定酶解时间为2 h,固定脂肪酶用量为质量分数0.09%,将第二次酶解温度设置为20、30、40、50、60 ℃,对第二次酶解温度进行单因素实验;固定酶解温度为40 ℃,固定脂肪酶用量为质量分数0.09%,将第二次酶解时间设置为1、1.5、2、2.5、3 h,对第二次酶解时间进行单因素实验。以上单因素实验均以感官评价分数为指标,研究脂肪酶对海参内脏多肽气味与口感的影响。感官评价方法见1.2.3。

1.2.5 响应面法优化实验设计 在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken设计方案,脂肪酶用量(A)、第二次酶解温度(B)和第二次酶解时间(C)为试验因素,并以1、0、-1分别代表变量的水平,以感官评价得分作为响应值,试验因素与水平设计见表2。应用Design-Expert软件对试验数据进行回归分析和响应面分析。感官评价方法见1.2.3。

表2 响应面分析试验因素水平表Table 2 Factors and levels of the response surface design

1.2.6 与漂洗法对比实验样品制备 目前公开的文献大多仅提及前处理过程中进行清洗,未对清洗方法做详细公开[13],本研究参照工业常规漂洗方法,综合考虑产率与风味,对漂洗方法进行了设计。对去除生殖腺的海参内脏原料进行漂洗,共漂洗3次,每次水量为原料质量的5倍,漂洗时间30 s。将漂洗后的原料按照1.2.2的方法进行海参多肽制备,唯一的区别是酶解过程不添加脂肪酶,仅使用蛋白酶进行酶解,其他条件参照1.2.3响应面法优化得到的最优条件,标记为样品1。通过1.2.3响应面法优化得到的最优条件制备的样品,标记为样品2。对样品1与样品2的感官评价得分、色泽、产率进行比较。

1.2.7 色泽测定和产率计算 色泽使用色差仪进行测量。产率计算公式如下:

1.3 数据处理

除响应面试验外,上述所有试验均重复三次,取平均值。响应面分析软件为Design-Expert V8.0.6.1。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 脂肪酶用量对感官评价分数影响 由图1可知,未使用脂肪酶的情况下,海参内脏多肽的气味与口感得分均在2分以下,感官评价较差,具有浓重的刺激性气味和明显的苦涩麻辣口感,且腥味较重,对多数人来说感官上难以接受。随着脂肪酶用量的增加,气味最先得到改善,在用量0.03%时即得到4分,基本上解决刺激性气味的问题;用量0.06%及以上时,气味得分趋于稳定,基本不再上升。口感得分的规律与气味得分不同,其改善滞后于气味得分,在用量0.09%时达到峰值,苦涩麻辣口感基本消失,腥味轻,同时具有浓郁的海参特征风味;用量进一步提高时,海参特征风味也趋于弱化直至消失,导致评分下降。

图1 脂肪酶用量对海参多肽感官得分影响Fig.1 Effect of lipase mass fraction on sea cucumber viscera polypeptide

2.1.2 第二次酶解温度对感官评价分数影响 脂肪酶是一类适用温度范围较广的酶,多数脂肪酶的最适温度在30～60 ℃,在较高和较低温度下仍具有较高活性[14]。由图2可知,脂肪酶在酶解温度30～60 ℃范围内对海参内脏多肽的气味与口感均具有明显的优化作用,在40 ℃时获得最高感官评分。

图2 第二次酶解温度对海参多肽感官得分影响Fig.2 Effect of second enzymolysis temperature on sea cucumber viscera polypeptide

2.1.3 第二次酶解时间对感官评价分数影响 根据图3,可发现酶解时间对海参内脏多肽风味优化作用的影响与脂肪酶用量趋势类似,气味与口感得分在作用2 h时即达到平稳不再下降,而口感得分在2 h时达到峰值,随后因海参特征风味的弱化导致评分下降。

图3 第二次酶解时间对海参多肽感官得分影响Fig.3 Effect of second enzymolysis time on sea cucumber viscera polypeptide

海参内脏多肽的不良风味机理尚不明确,就目前研究所知,可能与体系成分复杂、酶解过程中多肽疏水基团暴露、皂苷与多糖等活性物质含量丰富等原因有关,同时具有腥味[4,6]。高子阳等[15]将味苦麻舌的格皮氏海参切片提取过皂苷后,其麻舌感消失,因此推测麻舌感的来源可能为含量丰富的皂苷。海参内脏中皂苷含量远高于体壁,在1%以上[4],可推测丰富的皂苷是海参内脏多肽风味不良的原因之一。

脂肪酶的作用产物通常不是单一的,原因主要是脂肪酶催化的化学反应种类较多,并且都为可逆反应,而且反应可能不完全[9]。脂肪酶在海参内脏多肽酶解反应的过程中发生复杂的酯解、酯交换、醇解、酸解、糖苷键解离等反应,有可能包括皂苷糖苷键的水解,导致苦味与麻涩口感的消失;同时解离出的游离脂肪酸有利于体系的乳化,对不良风味具有包埋作用。脂肪酶具有界面激活特性,当处于油水界面时,“盖子”结构疏水侧暴露于脂相中,“盖子”打开,脂肪酶露出一个大的疏水表面[16-17]。因此反应可能形成与苦味肽疏水基团的疏水相互作用,促进包裹于蛋白质结构内部的疏水片段的暴露,使疏水氨基酸加速酶解,从而降低苦味。反应解离出游离脂肪酸,在搅拌作用下促进了体系的乳化,促进了不良风味的掩蔽。

2.2 响应面法优化实验结果

2.2.1 多元回归结果分析 以感官评价分数为响应值(Y)进行响应面分析,试验方案及结果见表3,回归分析结果见表4。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface design and results

表4 回归分析结果Table 4 Results of regression analysis

利用Design Expert软件对表4数据进行多元回归拟合,得到感官评价分数对脂肪酶用量(A)、第二次酶解温度(B)、和第二次酶解时间(C)的二次多项回归模型:

Y=9.36+0.18A+0.66B+0.44C+0.050AB-0.25AC+0.025BC-0.34A2-1.47B2-0.52C2

由表4可知,回归模型极显著(p<0.01);而失拟项不显著(p=0.1511),表明该模型拟合程度良好。方程决定系数R2=0.9748,方程校正系数 AdjR2=0.9423,拟合优度较高。数据分析结果表明可以用此模型来对脂肪酶优化海参内脏多肽提取工艺进行分析和预测。从表5可以看出,B、C、B2、C2对结果的影响极显著(p<0.01),A2对结果的影响显著(p<0.05),A对结果的影响不显著,但<0.1。交互项AB、AC、BC对结果的影响均不显著。对感官评价分数影响的大小依次为第二次酶解温度(B)>第二次酶解时间(C)>脂肪酶用量(A)。

2.2.2 感官评价分数的响应面分析与优化 应用 Design Expert 软件,绘制响应面图。比较3组图可知,第二次酶解温度与第二次酶解时间对海参内脏多肽感官评价的影响均为极显著,表现为曲线较陡,而脂肪酶用量的影响相对较小;3个响应曲面均为开口向下的凸形曲面,说明响应值存在极大值。结合二次回归模型的分析结果,感官评价得分最高的工艺参数为脂肪酶用量为质量分数0.09%,第二次酶解温度42.31 ℃,第二次酶解时间2.20 h,得分为9.53分。根据实际条件,选择脂肪酶用量为质量分数0.09%,第二次酶解温度42 ℃,第二次酶解时间2.2 h。以此为实验条件进行回归验证,得到的气味得分为4.9分,口感得分为4.7分,总分9.6分,与回归分析得到的结果基本一致。试验结果表明,脂肪酶应用于海参内脏多肽的风味优化具有显著的效果,有效消除产品的刺激性气味与苦涩麻辣口感,同时具有海参特征风味。

2.3 与漂洗法对比结果分析

由表5可知,将原料预先进行多次漂洗的方法对于海参内脏多肽的风味优化具有一定的作用,可部分消除产品的腥味,但是对于刺激性气味与苦涩麻辣的口感作用有限;漂洗法得到的产品为浅褐色,颜色较深;漂洗造成了活性成分的大量损失,产率不理想。使用脂肪酶法对海参内脏多肽进行感官优化,可在降低腥味的同时有效消除产品的刺激性气味与苦涩麻辣口感,使产品变得柔滑适口;与漂洗法相比,产品的色泽也得到了一定的改善,为米色或深米色,与漂洗法相比更偏向红色调与黄色调,色泽较为明亮,这可能是因为解离出的游离脂肪酸增进了乳化作用,或者酚类物质与游离脂肪酸结合避免了氧化所导致的;产率较理想,接近漂洗法的二倍。

表5 脂肪酶法与漂洗法对比结果Table 5 Comparison between methods with lipase and rinsing

图4 脂肪酶用量与第二次酶解温度 对海参内脏多肽感官评价的影响Fig.4 Effect of lipase mass fraction and second enzymolysis temperature on sensory evaluation of sea cucumber viscera polypeptide

图5 脂肪酶用量与第二次酶解时间 对海参内脏多肽感官评价的影响Fig.5 Effect of lipase mass fraction and second enzymolysis time on sensory evaluation of sea cucumber viscera polypeptide

图6 第二次酶解温度与第二次酶解时间 对海参内脏多肽感官评价的影响Fig.6 Effect of second enzymolysis temperature and second enzymolysis time on sensory evaluation of sea cucumber viscera polypeptide

3 结论

本文将脂肪酶应用与海参内脏多肽的制备,通过感官鉴定实验,证实可有效修正其不良口感,改善其感官性状。经响应面优化后获得最优工艺参数为脂肪酶用量为质量分数0.09%,第二次酶解温度42 ℃,第二次酶解时间2.2 h,得分为9.6分。与工业中常规应用的漂洗法相比,本方法气味、口感感官鉴定得分,色泽、产率均得到优化与提升,可以此为依据对海参内脏多肽生产工艺进行改进,使其成为优质的功能性食品、保健食品、医用食品原料。本文首次将脂肪酶应用于海洋多肽制品的优化,拓展了其应用范围。然而,感官性状改善机理尚不完全明确,也未进行实验验证,仅通过文献查阅及实验结果分析推测为皂苷、风味不良脂质的分解与交酯化、乳化作用导致,还有待进一步研究。