枯草杆菌蛋白酶QK的活性与氨基酸突变位点的相关性

杨媛媛,周 立,唐艺萍,刘秋晨,梁 宁,王业富

(武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室,湖北武汉 430072)

枯草芽孢杆菌分布范围广、抗逆性强,是人们最早发现的细菌之一[1]。它能产生芽孢,对高温、酸碱等环境有极强的抗性。它的生长环境多样化,因此具有丰富的产酶系统,可以将多种蛋白质直接分泌到周边环境中,已成为工业酶生产应用最广泛的菌种之一[2]。枯草杆菌蛋白酶是一种碱性的丝氨酸蛋白酶[3],人们对它的使用可以追溯到一千年前,日本人利用枯草芽孢杆菌并采用固态发酵的方法制作传统食品—纳豆[4]。而今,枯草芽孢杆菌在工业发酵产酶上的应用也越来越普遍[1-2]。

枯草芽孢杆菌能分泌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin QK,QK蛋白),QK蛋白由381个氨基酸组成,具有溶栓活性,与纳豆激酶(nattokinase)高度同源,可以用于治疗血栓性疾病,具有抗菌、促消化和提升免疫力的功能[3-5]。对于QK蛋白的研究,一般以提高酶活力为标准,或优化发酵条件,或利用生物工程的方法对枯草芽孢杆菌的某些位点进行突变[6-7]。尚无有关天然QK蛋白的氨基酸序列位点突变与其酶活力相关性的研究。本研究从不同的市售纳豆产品种中分离筛选天然的枯草芽孢杆菌,对它们的QK基因进行测序,通过蛋白质比对,初步发现酶活大小与枯草杆菌蛋白酶氨基酸位点变化的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株信息:从广东双骏生物科技有限公司(2/5/6号菌株)、安徽正东生物科技有限公司(3/11/12号菌株)、上海葳环进出口有限公司(7/13/14号菌株)、上海顶舜颖生物科技有限公司(1/4/10/15号菌株)和日研食品杭州有限公司(8/9号菌株)等5个公司分别购入两个批次的QK蛋白粉,用生理盐水溶解后摇培,划线培养,挑单菌落而得。

DL2000 DNA Marker、细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型) 天根生化科技有限公司;PCR MasterMix 康为世纪;高保真、高效率、高速PCR酶KOD-Plus-Neo TOYOBO公司;胶回收试剂盒 Axygen;尿激酶(Urokinase) 国家药品标准物质中心;纤维蛋白原(Fibrinogen)、凝血酶(Thrombin) Sigma公司;PMD19-T TaKaRa公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒 Biosharp公司;其他试剂 武汉阿玛迪生物技术有限公司,试剂均为分析纯。

超净工作台 苏净安泰AIRTECH;多功能酶标仪 美谷分子仪器(上海)有限公司;恒温恒湿培养箱 上海精宏实验设备有限公司;恒温摇床 武汉瑞华仪器设备有限责任公司;PCR仪 TaKaRa生物公司;高压灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;电泳槽 北京君意电泳设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 LB培养基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化钠10 g,用去离子水定容至1 L。固体培养基在此基础上加入琼脂15 g。

种子培养基和基础发酵培养基:按文献[8]进行配制。

1.2.2 菌株的分离与初筛 参照马明等[8]的方法进行初筛,在无菌条件下分别称取15份蛋白粉样品1.00 g,加入到装有9 mL生理盐水的培养瓶中,200 r/min、37 ℃振荡摇培30 min,划线接种至固体LB培养基上,37 ℃恒温培养12 h后,共挑取到15个单菌落。将15个单菌落分别转移到另一LB平板上,继续培养3天,观察菌落形态。

1.2.3 基因组DNA的提取与引物设计 将1.2.1中挑选出的15个单菌落分别接种至LB液体培养基中,200 r/min、37 ℃恒温培养12 h后,采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取。根据NCBI已发表的枯草芽孢杆菌QK基因序列,利用Primer Premier 5软件对基因序列进行分析,设计引物如表1所示,引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.4 16S rRNA序列分析法验证15株菌株 参考雒焕贞等[9]的方法进行。以枯草芽孢杆菌的总DNA为模板,用引物27F/1492R进行PCR扩增。25 μL反应体系为:12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix,1 μL(10 μmol/L)上下游引物,1 μL模板DNA,ddH2O补足至25 μL。

反应程序为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃复性30 s,30个循环;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。扩增产物以27F/1492R为引物,送至生工生物工程公司进行测序,测序结果输入NCBI中做同源序列搜索。

1.2.5 高保真PCR扩增QK基因序列 将1.2.3的PCR产物经胶回收柱纯化,然后与克隆载体PMD19-T Vector连接,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,之后于37 ℃摇床预孵育1 h,涂蓝白斑筛选培养基,37 ℃培养过夜,挑取白斑进行菌落PCR[10]。以QKF/QKR为引物,以KOD-Plus-Neo试剂盒进行高保真PCR 扩增。50 μL反应体系为:5 μL 10×Buffer,3 μL MgSO4,5 μL dNTPs,1 μL酶,1.5 μL(10 μmol/L)上下游引物,1 μL模板DNA,ddH2O补足至50 μL。

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反应程序为:94 ℃预变性2 min;98 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,68 ℃复性60 s,33个循环;68 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR扩增产物经1%的琼脂糖电泳后,用Axygen胶回收试剂盒回收目的片段。

电泳检测后送到上海生工生物公司进行核酸序列测定。将菌株序列输入NCBI中进行比对,找出其与QK蛋白的氨基酸序列不同的位点。

1.2.6 枯草杆菌蛋白酶QK粗提液的制备 参考文献[9]的方法。挑选LB固体培养基上的单菌落接入液体种子培养基中(装液量为2 mL·20 mL-1),37 ℃、200 r/min恒温摇培18 h。以3%接种量接种至液体发酵培养基(装液量为20 mL·250 mL-1),37 ℃、200 r/min恒温培养38 h。发酵液混合均匀即为枯草杆菌蛋白酶QK粗提液。

1.2.7 枯草杆菌蛋白酶活性测定 本实验应用纤维蛋白平板法[11-12]测定酶活性,这也是目前国家卫生部测定尿激酶等溶栓酶活力的标准方法。以凝血酶和纤维蛋白原作用后制成人工血栓平板,以尿激酶为标准品,得出酶活力(IU/mL)与透明圈面积S(cm2)的关系。

尿激酶标曲的制作:尿激酶的Tris-HCl(pH=8.8)溶液浓度分别为:620、310、155、77.5、38.75、19.375 IU/mL。用垂直直径的乘积的常用对数(lgS)为横坐标,标准尿激酶浓度的常用对数(lgIU)为纵坐标,制作尿激酶酶活的标准曲线,根据尿激酶溶栓活性标准曲线求出样品的酶活力大小。

1.2.8 枯草杆菌蛋白酶QK粗提液蛋白含量测定 本实验利用Biosharp公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量,配制梯度浓度的牛血清白蛋白(BSA)溶液:0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000 μg/mL,利用多功能酶标仪测定各浓度的BSA溶液在562 nm处的吸光值,绘制关于蛋白浓度和吸光值的标准曲线,即可根据测定的吸光值求出蛋白的浓度。

1.2.9 单位酶活力的计算 得到蛋白浓度之后,结合所测得的酶活力大小,后者与前者的比值即为单位蛋白酶活力(IU/mg),以此来表示最终酶活力大小。计算公式表示为:

1.3 数据处理

实验中每个处理重复3次,采用SPSS 19.0软件进行数据的显著性分析,用GraphPad prism5软件作图。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌的菌种鉴定

2.1.1 菌株的菌落形态 在LB固体平板培养后观察15株芽孢杆菌的单菌落形态,从形状、颜色、含水状态等8个不同的方面进行描述,结果见表2。

表2 枯草芽孢杆菌菌落形态Table 2 Colony morphology of Bacillus subtilis

从菌落形态来看,15株菌株都是乳白偏黄色,不透明。不同菌株之间菌落形态的其他6个方面有一定差异,这与其他学者研究报道的枯草芽孢杆菌形态多样性的结论一致[10]。但根据菌落形态难以将其分类。

2.1.2 枯草芽孢杆菌16S rRNA和QK基因序列分析 16S rRNA序列经PCR扩增后的片段长度都在1.5 kbp左右,QK基因序列经PCR扩增后的片段长度都在1149 bp左右,如图1。

图1 PCR扩增QK基因Fig.1 Amplification of QK gene by PCR注:M:DL2000 DNA Marker; 1～15:15个菌株QK基因PCR产物。

15株菌株的16S rRNA经PCR扩增后送测序,将序列输入NCBI中进行同源搜索,所有15株的16S rRNA序列都与枯草芽孢杆菌具有超过99%的同源性。

2.1.3 枯草芽孢杆菌的QK蛋白序列分析 将15株菌株的QK基因序列输入NCBI中,与QK基因所对应的蛋白序列(GeneBank编号:CAE18180.2)进行比对(tBLASTx),氨基酸突变位点如表3所示。

表3 15株菌株的氨基酸突变位点Table 3 Amino acid mutation sites of 15 strains

对比后发现,15株菌株均有的突变位点有6个:L104H,G166D,R167G,S179A,F181L和T290N。其余突变根据氨基酸位点的不同可以分为四类,以下把它们依次分为A、B、C、D四组。A组有5个菌株,分别是2、5、6、8、9号,特有的突变位点为S184T;B组有3个菌株,分别是3、11、12号,特有的突变位点为Q90K,N193S,S236T,N365S;C组有3个菌株,分别是7、13、14号,特有的突变位点为N193S,S236T,A289V;D组有4个菌株,分别是1、4、10、15号,特有的突变位点为Q90K,N193S,S236T,A289V。

2.1.4 枯草杆菌蛋白酶QK粗提液的酶活大小测定 尿激酶标准曲线做出后,可根据方程得出各菌株的酶活大小。具体数据见表4。由表4可知,6号菌株的酶活最高,达到了347.610 IU/mL,且A组的5株菌株的酶活显著(p<0.05)大于其他三组的10株菌株。4号菌株的酶活最低,仅2.719 IU/mL,且D组的4株菌株的酶活都比较低,但是B、C、D三组的10株菌株之间的酶活无显著差异。而A组特有的突变位点为S184T,D组特有的突变位点为A289V,由此结果可初步判断S184T这一位点的突变能提高单位酶活,而A289V这一突变能降低单位酶活。

图2 尿激酶酶活标准曲线Fig.2 The standard curve of urokinase activity

2.1.5 枯草杆菌蛋白酶QK粗提液的蛋白浓度测定 根据实验结果所作标准曲线如图3所示。根据回归方程:y=0.368x+0.084,计算出15株菌株的蛋白浓度,结果见表4。D组的1号菌株蛋白浓度是18.410 mg/mL,显著低于其余的14株菌株。B组的3号菌株蛋白浓度最高,为35.235 mg/mL,但是除了与1号、8号的27.251 mg/mL有显著差异外,与其他菌株均无显著差异。蛋白浓度在组间的差异并不明显。

图3 牛血清白蛋白浓度标准曲线Fig.3 The standard curve of bovine serum albumin

2.1.6 枯草杆菌蛋白酶QK粗提液单位酶活的比较 单位酶活是以酶活与蛋白浓度的比值来定义的。用SPSS 19.0软件分析各菌株单位酶活数值,结果见表4。组间单位酶活比较结果见图4。

表4 15株菌株的酶活、蛋白浓度及单位酶活Table 4 Enzyme activity,protein concentration and unit enzyme activity of 15 strains

从15株菌株之间来看,单位酶活的大小差异较大,最低的是4号,仅有0.09 IU/mg,最高的是6号,达到了11.52 IU/mg。除此之外,还可以看出单位酶活的大小与组别联系密切:同一组之间的各菌株差别不大,不同组之间的差异明显。因此,对单位酶活进行了组间比较,得到图4所示的柱状图。

图4 各组单位酶活大小比较Fig.4 Comparison of enzyme activity in each group注:组间单位酶活比较采用One-Way ANOVA检验。 柱状图上不同字母表示有显著差异(p<0.05)。

A组的单位酶活最高,B、C组无显著(p>0.05)差异,D组最低。结合测定单位酶活的实验结果可以看出,单位酶活大小与突变位点的关系非常密切。其中,A组与其他组相比,QK蛋白氨基酸的S184T这一位点变化,可能对单位酶活性有促进作用。D组与C组相比,说明A289V这一位点的变化可能对单位酶活性有抑制作用。B组与C组相比,说明N365S的突变对单位酶活性的提升有积极作用。进而猜想184、289等位点可能位于枯草杆菌蛋白酶QK的活性中心。

3 结论

本实验对15株枯草芽孢杆菌的QK基因进行测序,测序结果与GenBank上已提交的QK基因所对应的蛋白序列(GeneBank编号:CAE18180.2)进行比对,根据突变位点的不同将这些菌株分为4组,除去15个菌株均有的6个突变位点:L104H,G166D,R167G,S179A,F181L和T290N。其余各突变如下:A组的突变位点为S184T,B组的突变位点为Q90K,N193S,S236T,N365S,C组的突变位点为N193S,S236T,A289V,D组的突变位点为Q90K,N193S,S236T,A289V。A组的单位酶活显著最高,B组和C组无显著差异但均显著低于A组,D组的单位酶活比其他三组显著最低(p<0.05)。据此,推测,S184T这一突变对于单位酶活有较大的提高作用,N365S这一突变对于单位酶活稍有提高作用,A289V这一突变对单位酶活有较明显的抑制作用。在以后的研究中,将会把来自15株菌株的QK基因克隆入载体,在毕赤酵母中表达蛋白,将蛋白纯化后进行比较,力求从根本上弄清楚上述位点是否位于枯草杆菌蛋白酶的活性中心。这对于提高QK蛋白在工业生产中的单位酶活性,提高工业生产的效率,有着非常重要的作用。