响应面法优化提取油茶籽壳棕色素与抗氧化活性研究

张宽朝 张 琛 阮 飞 何孔泉 杨 超

(安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036)

食用色素是用于改善食品质量和外观的重要食品添加剂[1]。近年来，在食品工业、制药和化妆品行业中食用色素被广泛应用。根据来源可将食用色素分为合成色素和天然色素两类。然而，随着医学毒理学和生物学研究的发展，发现合成色素中的不少品种具有慢性毒性和致癌性，因此天然色素的应用和探索受到了更多的关注[2]。从生物体内提取的天然色素，由于较高的安全性，另外还含有人体必需的营养物质，如维生素或其近似的化学类似物，具有很大的生物活性和对人体至关重要的抗氧化活性，逐渐为人们所重视，研究逐步深入[3,4]。棕色素是色素中的黄色物质与红色物质混合成的一类复合色素，常来源于植物成熟的果实、种子、果壳或果核中，可用于着色棕色食品[5]。目前，对龙眼、金樱子、榛壳、山核桃壳、板栗壳等中的棕色素进行了研究[6-10]。

油茶(CamelliaoleiferaAbel),山茶科山茶属常绿小乔木，分布于中国南方的18个省市。油茶是我国特有的木本油料作物，据“山海经”记载，油茶种子已在中国使用超过二千多年[11]。油茶的种子主要用于油脂提取，油茶籽还含有大量的生物活性多糖和蛋白质、脂肪、鞣酸、咖啡因、皂苷等其他活性成分，因此，可以进一步挖掘油茶籽的综合开发利用价值[12]。油茶籽壳为油茶籽质地坚硬的外种皮，主要含有木质素、多缩戊糖、色素和一定含量的抗氧化活性物质[13,14]。针对油茶籽壳的利用研究主要集中在活性炭、木糖醇和糠醛等产品的制备上，利用率较低[15]。刘晓庚[16]分析油茶副产品成分时发现，油茶果壳色素、茶饼粕色素的光稳定性和热稳定性较好。凌诚德等研究表明，国产食用天然色素油茶果壳棕色素具有巧克力样色泽，未发现明显的急性和亚急性毒性，可以作为一种很有前途的安全天然食用色素[17]。油茶籽壳中含有的色素成分尚未能得到有效地开发和应用，对油茶籽壳棕色素的提取等的研究鲜见报道。

本实验旨在探讨油茶籽壳棕色素的提取工艺，并通过响应面法试验设计优化工艺条件，同时采用体外实验测定提取棕色素的抗氧化活性，以期为油茶籽壳综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

成熟油茶籽：去仁留壳，60 ℃烘干，粉碎机粉碎，得油茶籽壳粉末备用。

无水乙醇，甲醇，丙酮，乙酸乙酯，过氧化氢，铁氰化钾，三氯乙酸，三氯化铁等均为分析纯。

FW100型高速万能粉碎机，RE-52旋转蒸发器，KQ-400DB型数控超声波清洗器， DHG-9425A电热恒温鼓风干燥箱，UV-1600紫外-可见分光光度计，HH-2J数显恒温水浴锅， JA2003C 电子天平。

1.2 方法

1.2.1 提取工艺

工艺流程：油茶籽壳粉末→溶剂浸提→抽滤→旋转蒸发器浓缩→真空干燥→产品称重。

棕色素含量(mg/g)=棕色素产品质量/油茶籽壳质量×1000。

1.2.2 不同提取溶剂比较

称取5.000 0 g油茶籽壳粉末，在液料比(10 ∶1)、提取温度(50 ℃)、提取时间(1 h)的条件下，分别用甲醇、50%乙醇、纯水、丙酮和乙酸乙酯作为提取溶剂，按提取工艺对油茶籽壳进行棕色素提取，研究不同溶剂对提取率的影响。

1.2.3 单因素实验

温度对提取率的影响：设置实验条件为乙醇浓度50%、液料比10 ∶1、提取时间1 h，研究提取温度(30、40、50、60、70 ℃)对油茶籽壳棕色素提取的影响。

液料比对提取率的影响：通过上述实验确定最佳提取温度，设置实验条件为乙醇体积分数50%、提取时间1 h，研究液料比(6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1、14 ∶1)对油茶籽壳棕色素提取的影响。

乙醇浓度对提取率的影响：通过上述实验确定最佳提取温度、液料比，设置实验条件为提取时间1 h，研究乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)对油茶籽壳棕色素提取的影响。

提取时间对提取率的影响：通过上述实验确定最佳提取温度、液料比、乙醇浓度，研究提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)对油茶籽壳棕色素提取的影响。

1.2.4 响应面法试验因素水平设计

在单因素实验的基础上，根据 Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选取温度(A)、液料比(B)、乙醇浓度(C)、提取时间(D)4个因素作为自变量，编码水平为-1、0 和1，以油茶籽壳棕色素提取含量为响应值，响应面试验因素编码及水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平设计

1.2.5 抗氧化能力测定

式中：A0是邻苯三酚自氧化速率；A1是样品溶液加入后的邻苯三酚氧化速率。

清除H2O2能力的测定：参考紫外分光光度法[19]。

还原能力的测定：参考铁氰化钾法[20]。700 nm处测定反应体系的吸光度，吸光度值越高,还原能力则越强。

2 结果与分析

2.1 不同提取溶剂比较

采用甲醇、50%乙醇、纯水、丙酮和乙酸乙酯作为提取溶剂，分别对油茶籽壳棕色素进行提取。结果如图1所示。从图1中可以看出，50%乙醇作为提取溶剂时油茶籽壳棕色素提取率最高，丙酮溶液次之，其后依次是甲醇、纯水、乙酸乙酯。后续实验选择乙醇作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对油茶籽壳棕色素提取的影响

2.2 单因素实验

温度、液料比、乙醇浓度、提取时间对油茶籽壳棕色素提取的影响如图2所示。

实验条件为乙醇体积分数50%、液料比10 ∶1、提取时间1 h时，油茶籽壳棕色素的提取率随着温度的升高呈现先增加后下降的趋势。在一定的温度范围内，随着温度的升高，可能色素分子运动的速度加快，有利于油茶籽壳棕色素的溶解和释放。提取温度为40 ℃时，油茶籽壳棕色素提取率达到最大。其后，随着温度的升高，可能伴随乙醇挥发加快以及色素化学结构的破坏，棕色素提取率有所下降。由此，选用40 ℃为最佳提取温度。

图2 不同因素对油茶籽壳棕色素提取的影响

实验条件为提取温度40 ℃、乙醇体积分数50%、提取时间1 h时，当液料比小于10 ∶1时，随着液料比的增大，油茶籽壳棕色素提取率逐渐增大，这可能是由于液料比的增加促进了更多的棕色素溶解在乙醇溶液中。当液料比大于10 ∶1时，可能因为棕色素已接近全部溶出，油茶籽壳棕色素提取率略有下降。由此，从油茶籽壳棕色素提取含量和原料节省方面考虑，选用10 ∶1为最佳提取液料比。

实验条件为提取温度40 ℃、液料比10 ∶1、提取时间1 h时，随着乙醇浓度的增加，油茶籽壳棕色素提取含量增加，当乙醇体积分数大于60%时，棕色素的提取量开始下降。这可能是因为乙醇浓度越高，对细胞的破坏程度越大，越有利于棕色素的析出，但当乙醇浓度过高时，可能会导致棕色素的部分降解，从而造成棕色素提取含量的下降。由此，选用60%乙醇体积分数为最佳提取浓度。

以提取温度40 ℃、液料比10 ∶1、乙醇浓度60%为实验条件，油茶籽壳棕色素提取质量随提取时间的增加呈现先增加后上升的趋势。提取时间为2.0 h时，油茶籽壳棕色素提取含量最高。其后，提取时间延长，棕色素发生氧化分解，导致提取含量开始降低。由此，选用提取时间2.0 h为最佳提取时间。

2.3 响应面优化分析

2.3.1 响应面分析方案

根据单因素实验结果，进行L9(34)试验设计，利用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken中心组合试验设计，试验设计与响应结果如表2所示。

表2 Box-Behnken试验响应结果

2.3.2 方差分析及显著性检验

用Design-Expert.8.0.6软件对表2所得数据进行回归模型方差分析。分析结果如表3所示。对各因素实验数据进行回归拟合，得回归方程为：

油茶籽壳棕色素提取含量=-79.311 3+1.191 18A+5.446 25B+0.940 65C+14.405 67D-0.022 75AB-4.75×10-4AC-0.166AD-0.019 25BC+0.767 5BD-0.013CD-8.532 5×10-3A2-0.226 44B2-5.382 5×10-3C2-4.103D2。

各因素的F值可以直观反映各因素影响的大小，F值越大，其对响应值的影响也越大。对各因素影响程度的分析可以发现，FA=0.048，FB=2.085×10-3，FC=15.07，FD=51.26，各因素对油茶籽壳棕色素提取含量影响大小顺序为提取时间>乙醇浓度>温度>液料比。

2.3.3 因素交互作用分析

为进一步分析温度、液料比、乙醇浓度、提取时间对响应值的影响，固定其中任两个因素，绘制另两个因素之间交互作用的等高线和响应面图，可视化分析各因素间的交互作用。

表3 回归模型方差分析

注:模型的确定系数R2=0.899 4,模型的调整确定系数RAdj2=0.798 8。**差异极显著(P<0.01)；*差异显著 (P<0.05)。

从等高线和响应面图可以看出各个因素之间的相互作用，直观反映各自变量对响应值的影响。等高线形状和响应面曲面坡度可以反映自变量交互效应的强度。等高线形状若趋向于椭圆形，则两自变量之间交互作用明显，若趋于圆形则相反；等高线密度大，表明因素间交互作用较强。响应面曲面的倾斜度越高，即坡度越陡，说明因素间交互作用越显著，同时，随着变化趋势的剧烈增加，曲面颜色也呈加深趋势。由此，分析可知，温度与提取时间、液料比与提取时间的交互作用对响应值油茶籽壳棕色素提取含量的影响显著(如图3、图4所示)，其他因素交互作用对响应值的影响不显著。因素交互作用的分析结果验证了回归模型方差分析。

2.3.4 最优工艺条件确定与模型验证

通过软件对方程进一步分析得出，提取的最佳条件为提取温度33.98 ℃，液料比10.99 ∶1、乙醇体积分数63.82%、提取时间1.99 h，在此条件下提取率的预测值为15.23%。由于对条件可操作性考虑，将最佳提取工艺条件修正为提取温度35 ℃、液料比11 ∶1、乙醇浓度65%、提取时间2h，经 3次验证性试验，得到提取率为15.09%，与预测值相偏差为0.91%，说明通过响应面优化后的提取条件参数可靠，具有一定的实践指导价值。

图3 温度及提取时间交互作用对油茶籽壳棕色素提取率的等高线和响应面图

图4 液料比及提取时间交互作用对油茶籽壳棕色素提取率的等高线和响应面图

2.4 油茶籽壳棕色素抗氧化能力测定

图5 油茶籽壳棕色素清除能力、清除H2O2能力及还原能力

在质量浓度10.0～100.0 μg/mL范围内，随着溶液质量浓度的增加，油茶籽壳棕色素对过氧化氢的清除率也随之增高。当质量浓度大于60.0 μg/mL时，油茶籽壳棕色素对过氧化氢的清除率趋向于平缓，基本维持在35%左右。

在实验浓度范围内，油茶籽壳棕色素溶液具有良好的还原性能力，可作为良好的电子供应者。随着棕色素质量浓度的最大，其还原能力也随之增强。

3 结论

以油茶籽壳为原料，考察了提取温度、液料比、乙醇浓度、提取时间4个因素对棕色素提取的影响，并采用响应面法优化了油茶籽壳棕色素提取工艺。结果表明，影响油茶籽壳棕色素提取含量高低的因素主次顺序为提取时间>乙醇浓度>温度>液料比，温度与提取时间、液料比与提取时间的交互作用显著。最佳提取工艺条件为提取温度35 ℃、液料比11 ∶1、乙醇体积分数65%、提取时间2h。在此条件下，得到油茶籽壳棕色素提取率为15.09%，与预测值基本一致。