组学技术在山羊乳研究中的应用

文/侯艳梅 吴 桐 谢奎詹 智 钧 陈 瑶 吴 红 刘晓红

（海普诺凯营养品有限公司）

山羊乳及其制品（包括液态山羊乳、发酵山羊乳、山羊乳奶酪和山羊乳粉）如今已经获得了行业与市场的广泛关注。山羊乳的营养价值主要在于以下几个方面：（1）同等质量的奶源中，山羊乳中的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白含量比牛乳少，因此致敏率低于牛乳；（2）山羊乳酪蛋白在酸化后形成的凝胶与牛乳酪蛋白凝胶相比，强度低且结构疏松，因此消化率更高[1]；（3）山羊乳天然的脂肪球颗粒较小，且中链脂肪酸甘油三酯比例较高，消化速率与代谢速率均快速、有效，是很好的能量来源[2]。

有关山羊乳成分与功能的研究已经持续了上百年，随着科技的进步，人们对山羊乳成分也有了更深入的了解。

山羊乳中蛋白质、糖蛋白、低聚糖、脂质等生物分子的结构和功能一直是乳品营养研究的核心。质谱技术的广泛应用很大程度上扩展了人们对乳制品生物活性物质的认识，因为它可以识别、定量和表征乳品中的蛋白质、碳水化合物和脂类[3]。近几年，以质谱技术为基础发展起来的组学技术，例如蛋白质组学、糖组学、糖蛋白质组学、脂质组学等可以对这些生物分子成分进行全面分析。

1蛋白质组学

“蛋白质组学”在20世纪90年代初首次提出，被定义为系统地分离、鉴定、表征常见来源的蛋白质。与传统的生化分析法不同，蛋白质组学方法能够同时、清晰地分析复杂混合物中的全部蛋白质。可用于研究不同品种、不同地域山羊乳的高丰度与低丰度蛋白质种类，山羊乳在哺乳期和加工过程中蛋白质变化以及评估山羊乳品质。从广义上讲，蛋白质组学结合了两种主要技术：分离和表征。其中分离技术主要有双向凝胶电泳（SDSPAGE）、高效液相色谱（HPLC）等；表征技术包括质谱（MS）分析、纳米电喷雾质谱技术（nESI）等[4]。蛋白质组学技术在山羊乳研究中的应用如下。

1．1 区分山羊乳与其他乳

乳蛋白是极其复杂的混合物，由酪蛋白（αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白等）和乳清蛋白（α-乳白蛋白，β-乳球蛋白，乳铁蛋白等）组成。分析不同物种乳蛋白的种类，可以了解乳营养成分的差异。

Eek等[5]利用SDS-PAGE和液相-质谱联用（HPLC-MS）技术研究了马来西亚国内人乳、牛乳、山羊乳的蛋白质特征。结果发现，牛乳和山羊乳中没有人乳中所含的乳清白蛋白、甘露糖受体、羧酸酯脂肪酶、血清白蛋白等小分子蛋白，这一发现为开发更接近母乳的婴幼儿配方乳粉提供了参考依据。

Yong等[6]使用蛋白质组学方法分析了奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、山羊乳和骆驼乳中的乳清蛋白质，为鉴定特种乳提供了依据。该研究表明，二聚糖（一种富含亮氨酸的蛋白多糖）在山羊乳中含量较高，可作为山羊乳的特征蛋白；丛生蛋白（一种高度糖基化的蛋白质）可作为水牛乳的特征蛋白；伯胺氧化酶可作为牛乳的特征蛋白（表1）。

表1 不同奶畜乳中丰度较高蛋白质种类

1．2 开发低致敏性乳制品

乳制品过敏症状归因于免疫球蛋白IgE介导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞活化以及过敏原特异性T细胞活化，依据IgE与T细胞识别过敏原的数据可知，乳中αs1-酪蛋白是主要的致敏物质[7]。Paola等[8]利用SDS-PAGE结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOF-MS）证实，山羊乳中的总酪蛋白含量与αs1-酪蛋白的基因型相关。有关山羊乳αs1-酪蛋白（αs1-CN）多态性的研究表明，αs1-酪蛋白的合成水平受不同基因亚型的控制，其中亚型αs1-CNA, αs1-CNB, αs1-CNC属于强等位基因，亚型αs1-CNE属于中间等位基因，亚型αs1-CND和αs1-CNF属于弱等位基因，亚型αs1-CN0属于无效等位基因。这4类等位基因与山羊乳中αs1-酪蛋白含量的关系见表2。

由此可知，强等位基因山羊所产的羊乳，其中αs1-酪蛋白含量较其他基因型羊乳高，因此致敏性也相对较高。这一发现对开发低敏性羊乳是一个重要启示，可筛选具有αs1-酪蛋白中间等位基因、弱等位基因或者无效等位基因的山羊为过敏者生产乳制品。

1．3 研究乳蛋白在哺乳期内的变化

研究哺乳期内乳蛋白成分变化可以提升人们对乳生物学和功能的理解。初乳为新生儿提供营养并增强其免疫力，但随着初乳向成熟乳转变，乳中的蛋白质组分也会发生复杂的变化[9]。已有研究表明，初乳与成熟乳中的蛋白模式有明显差异，纤维蛋白原β链、几丁质酶3样蛋白1、α-抗胰蛋白酶、补体C3α链、凝溶胶蛋白和载脂蛋白H等小分子蛋白仅能在初乳中被检测出[10]，而β-酪蛋白片段却在成熟乳中明显增加，因此研究哺乳期乳蛋白的变化规律具有重要意义。

Jing等[11]研究了乳脂肪球膜蛋白在山羊初乳和成熟乳中的差异和作用。结果表明，在初乳的乳脂肪球膜蛋白中，急性期反应蛋白、参与翻译和细胞骨架的蛋白等181 种蛋白质丰度显著高于成熟乳，这些蛋白主要来自于细胞质、细胞膜以及胞外区域，具有结合鸟苷酸，结合细胞表面和结构分子活动（Structural Molecule Activity）的功能，在生命初期可以保护新生儿。黄嘌呤脱氢酶/氧化酶（XDH）、整合膜蛋白（STOM）和粘蛋白15（MUC15）等8 种乳脂肪球膜蛋白质在成熟乳中丰度较高，前两种有助于泌乳细胞高效持续的产奶。

表2 不同等位基因与山羊乳中αs1-酪蛋白含量关系

1．4 评估不同品种山羊乳蛋白的品质

山羊乳蛋白质组成因山羊品种不同而变化，并可能呈现地域差异。

Whyara等[12]比较分析了来自巴西东北部的Alpine和Saanen两个品种山羊乳的蛋白质组成，并评估其抗菌活性，结果显示：两种山羊乳中均不存在αs1-酪蛋白，并且这两种山羊乳的αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的组成也没有差异，结论为这两种山羊均可作为低敏性奶源。两种山羊乳中乳酪蛋白的蛋白质组分（F60%～90%）都可以抑制细菌生长，抑制浓度在50～100 mg/mL之间。

Athanasios等[13]研究了希腊不同品种羊的乳蛋白质。结果表明，Skopelos山羊乳共有229 个蛋白组，Capra prisca山羊乳共有338 个蛋白组。该研究扩充了山羊乳蛋白数据库，并对山羊饲养提供指导。

1 ．5 探 究 加 工 过 程 对 蛋 白质的影响

乳和乳制品在加工储存过程中发生的化学变化会影响其品质与营养。这些化学变化包括美拉德反应、脂质氧化、脂肪分解、蛋白水解和蛋白质交联。研究最广泛的是热处理过程中发生的美拉德反应，在该反应中，乳糖与赖氨酸ε-氨基上的蛋白质结合，形成结构稳定的乳糖基-赖氨酸，会导致蛋白质的消化率以及赖氨酸的生物利用度降低[14]。

Losito等[15]研究了巴氏灭菌乳、UHT灭菌乳和喷雾干燥乳粉中蛋白质糖基化程度。结果表明，乳糖化形式的β-乳球蛋白在上述3 种乳制品种中分别占总β-乳球蛋白的3%、30%和70%。因此，检测蛋白的糖基化程度，可为后期优化生产工艺提供检验标准。

1．6 检测山羊乳掺假

Chen等[16]以β-乳球蛋白作为标记物，利用溶剂分离乳清蛋白，再联合高HPLC和电喷雾质谱（ESI-MS），得到了一种用于鉴定山羊乳中是否掺有牛乳的方法，此方法中，当牛乳添加量超过5%即可被检出。

Nicolao等[17]基于质谱和多变量统计分析方法检测不同混合乳中的牛乳含量，当混合乳中牛乳含量超过2%即可检出。

2 脂质组学

乳制品被认为是富含各种生物活性脂质的有机物，脂质可分为甘油脂、鞘脂、甘油磷脂、异戊烯脂、糖脂、聚酮化合物、甾醇和脂肪酰基[18]。

脂质组学是研究脂质在生命活动中的代谢调控机制，从系统水平上研究生物体内的脂质，揭示其相互作用及与其他生物分子作用的新学科[19]。在食品科学领域，脂质组学主要应用于分析不同生物资源的脂质成分，探讨改性反应机理及反应条件的优化，监控食品质量以及评估生物体内脂质功能和营养水平[20]。

乳脂中的脂肪酸大多以甘油三酯（TAG）的形式存在。了解甘油三酯特征对鉴定乳脂来源和优化乳脂成分具有重要意义。通过脂质组学技术，甘油三酯的特征可从同型甘油三酯、脂肪酸组成水平以及脂肪酸位置水平3 个方面进行描述[21]。

2．1通过同型甘油三酯鉴定乳脂类别

同型甘油三酯是指具有相同总碳数（CN）的一类甘油三酯。依据同型甘油三酯鉴别乳脂类别是一种有效的方法[22]。

Fontecha等[23]利用气相色谱（GC）分析了西班牙山羊乳与牛乳的同型甘油三酯。结果发现，尽管山羊乳与牛乳都含有16 种同型甘油三酯（碳原子数从24～54），但牛乳中C38，C50～C52类同型甘油三酯的相对含量较高，而山羊乳中C40和C42类同型甘油三酯相对含量较高，这些不同类别的同型甘油三酯的相对含量可用于区分山羊乳脂和牛乳脂。同样的方法还可有效检测山羊乳脂中的其他动物脂肪[24]，或者乳脂中的非乳脂肪[25]。

随着检测技术的发展，越来越多的同型甘油三酯被鉴定出。Fontecha等[26]使用银离子薄层层析联用（Ag+-TLC）和气质联用（GC-MS）技术鉴定出了山羊乳中137 种同型甘油三酯。Ruiz-Sala等[27]使用HPLC与GC组合法鉴定出了山羊乳中181 种同型甘油三酯。

2．2 通过脂肪酸组成水平反映乳脂质量

分析同型甘油三酯虽然可得出有关乳脂中甘油三酯的信息（如质量分布、总碳数分布等），但不能揭示每组乳脂中的脂肪酸数量和种类。研究甘油三酯中脂肪酸的组成不仅可以了解脂质的物理性质（例如熔点、结晶性能和流变性质）和生理功能，更有助于探究乳腺中甘油三酯分子的合成途径[20]。

Gantner等[28]回顾了人乳、马乳、驴乳、水牛乳、奶牛乳、山羊乳和绵山羊乳等7 种乳的乳脂组成。得出结论，反刍动物乳（水牛、奶牛、山羊、绵羊）和非反刍（马和驴）动物乳之间存在很大差异。在脂肪酸组成上，非反刍动物的饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸较反刍动物低，但多不饱和脂肪酸含量高，尤其是十八碳二烯酸和十八碳三烯酸，反刍动物与人乳的乳脂中胆固醇含量比较接近。在非反刍动物中，血糖是主要的脂肪酸前体，而在反刍动物中，微生物产生的乙酸和β-羟基丁酸，是C4-C16脂质的主要前体[21]。

Qiang等[29]使用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱联用技术（UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）分析山羊乳、大豆乳和牛乳中脂质的多样性。结果表明，豆浆富含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰甘油等磷脂；山羊乳富含中链甘油三酯（MCT）、不饱和脂肪酸、ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）含量优于豆浆和牛乳；牛乳中富含神经酰胺、甘油三酯和甘油二酯。

2．3 确定脂肪酸位点，优化乳脂结构

脂肪酸在甘油骨架上的位置影响了脂肪酸的消化吸收，饱和脂肪酸（例如棕榈酸）在sn-2位点时的吸收率会高于在sn-1和sn-3位点。

Cong等[30]利用气相质谱（GC）分析出，人乳中70%～80%的十六烷酸位于sn-2，牛乳中40%的十六烷酸位于sn-2，植物油中5%～20%十六烷酸脂肪酸位于sn-2，而山羊乳中的棕榈酸有50%位于sn-2。研究脂肪酸在甘油三酯中的位点对于油脂改性和配方乳粉乳脂成分母乳化具有指导意义。

2．4 研究饲养环境对乳脂的影响

在热带、亚热带地区，山羊发生热应激对产奶量和乳成分都有潜在影响。

Liu等[31]利用液质联用（LCMS）方法研究了澳大利亚热应激效应对牲畜产奶的影响。结果发现，在热应激下，乳中甘油三酯和磷脂的质谱均会发生改变，即短链和中链脂肪酸含量降低，长链脂肪酸含量升高；磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱和葡糖神经酰胺五种极性脂类的丰度显著降低。耐热的牲畜比不耐热的牲畜所产乳中的溶血磷脂酰胆碱含量高，因此溶血磷脂酰胆碱可作为热应激生物标志物。

这一研究将为在热带、亚热带农场选育适宜的奶牛、奶山羊以及如何改善饲养环境提供参考。

3 代谢组学

代谢组学是研究生命体受到内外界刺激或基因修饰后所产生的与时间序列相关联的众多代谢产物的一门学科。作为基因组学和蛋白质组学的继承者，代谢组学将关注点从基因转移到小分子代谢物，将细胞、组织和生物体整个过程联系起来。因此，在代谢物水平上研究生物系统可以更深刻的理解营养学、毒理学、医学、生理学和病理学[32]。代谢物与乳成分之间的关系可以帮助理解乳品的生化特性和加工特性，并且可以突出作为生物标记物的小分子特征。

目前，常见的代谢组学的数据采集主要釆用质谱（MS）和核磁共振谱（NMR）为核心的分析技术，再辅助以一些高效的分离设备，共同组合成代谢组学所使用的设备。设备类型包括气相色谱-质谱联用（GC-MS）、高效液相色谱-质谱联用（LC-MS或LCMS/MS）、高效液相色谱-核磁共振联用（HPLC-NMR）、高效液相色谱-核磁共振-质谱联用（HPLC-NMR-MS）技术等。

代谢组学技术已广泛应用于人乳和牛乳的研究，但在山羊乳方面还处于初级阶段，主要应用于以下几方面。

3．1 作为山羊乳及其制品标记物

Caboni等[33]利用GC-MS仪器，使用非靶向代谢组学方法研究30只绵羊和28 只山羊奶的代谢物谱。结果显示了代谢物谱的差异，绵羊奶中的阿拉伯糖醇、柠檬酸、α-酮戊二酸、甘油酸、肌醇和甘氨酸含量较高，山羊奶含有较高水平的甘露糖-6-磷酸盐、异麦芽酮糖、缬氨酸、焦谷氨酸、亮氨酸肌醇和岩藻糖。

Paola等[2]通过GC-MS和多变量统计数据，研究了市售山羊乳的代谢物库，并将实验数据与牛乳进行比较。结果表明，苹果酸是牛乳的特征代谢物；缬氨酸和甘氨酸是山羊乳的特征代谢物，且缬氨酸味苦，甘氨酸味甜，影响了山羊乳特殊风味。同时，缬氨酸、甘氨酸与亮氨酸、异亮氨酸共同参与支链脂肪酸的代谢。

因此，能够根据其代谢物谱来区分奶源类型，以便鉴别山羊乳是否掺其他乳。

3 ．2 作 为 不 同 基 因 型 山 羊乳的标记物

前文提到，山羊乳的αS1-酪蛋白等位基因具有不同亚型，Pierluigi等[34]利用GC-MS和多变量数据分析技术，揭示山羊不同α-酪蛋白基因型中的乳代谢物差异。结果表明，拥有强等位基因的山羊乳代谢产物为柠檬酸和乌头酸，对于弱等位基因的山羊，其山羊乳的代谢产物为不同的糖类和多元醇。

3．3 研究不同加工过程对山羊乳的影响

Caboni等[33]通过GC-MS和多变量统计数据，分析、研究UHT灭菌和巴氏灭菌热处理对乳制品代谢物的影响。结果表明，牛乳和山羊乳经过巴氏杀菌后都含有羟基戊二酸，山羊巴氏杀菌乳的特征代谢物为核糖。牛乳UHT灭菌后特征代谢物为葡萄糖和果糖，这是因为牛乳中乳糖含量高于山羊乳，所以在经过UHT处理后乳糖被水解成了单糖。

4 小结

组学技术可以在全球范围内识别、量化、表征乳中的成分，其的应用改变了乳品科学[3]。不断发展的分离方法和质谱联用技术促使组学技术更广泛的应用于鉴别乳品原料的安全性、评估乳制品加工方法的合理性、考察营养素在人体内的生物利用率等，以便开发出更优质的产品。