不同部位雪茄烟叶晾制过程中多酚、色素及相关酶活性的变化

卢绍浩　张嘉雯　赵喆　钟秋　宋朝鹏　张瑞娜　赵铭钦

摘  要：为明确晾制过程中雪茄烟叶多酚类物质和质体色素的降解规律以及相关酶活性的动态变化，以德雪1号为试验材料，研究了不同部位烟叶晾制期间多酚类物质、质体色素及相关酶活性的变化规律，并进行了相关分析。结果表明，不同部位雪茄烟叶中多酚类物质含量主要表现为中部叶>下部叶>上部叶，其中各部位绿原酸含量均呈下降趋势，而芸香苷和莨菪亭含量均呈现单峰曲线。各部位质体色素含量随着晾制过程的推进而逐渐降低，整体表现为上部叶>中部叶>下部叶。各部位烟叶中脂氧合酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、过氧化物酶等酶活性均呈先增后降趋势。相关分析表明，晾制期间各部位多酚氧化酶活性与多酚、色素含量呈正相关，且与绿原酸和β-胡萝卜素达到显著水平;苯丙氨酸解氨酶活性与多酚、色素含量呈负相关，且与绿原酸达到显著水平。过氧化物酶与脂氧合酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶均呈显著正相关，因此在晾制过程中合理调控各类酶活性，可以控制多酚类物质及质体色素含量，有利于提高雪茄烟叶调制特性。

关键词：雪茄烟叶;晾制;多酚类物质;质体色素;酶活性

中图分类号：S572.03          文章编号：1007-5119（2019）03-0084-07      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.012

： In order to clarify the degradation of polyphenols and plastid pigments and the changes of related enzyme activities in cigar leaves during air-curing， taking Dexue No.1 as the test material， the changes of polyphenols， plastid pigments and related enzyme activities in leaves at different positions of cigar tobacco were studied， and the correlation analyses were carried out. The results showed that the polyphenol contents showed cutters > lower leaf > upper leaf at different positions of cigar plants. The chlorogenic acid content showed a downward trend at all positions， but rutin and scopoletin showed a single peak curve. The plastid pigment gradually decreased with the air-curing process， and it showed upper leaf > cutters > lower leaf. The activities of lipoxygenase， phenylalanine ammonia lyase， polyphenol oxidase and peroxidase at different positions of cigar first increased and then decreased. Correlation analysis showed that polyphenol oxidase activity was positively correlated with polyphenols and pigment content at different positions during air-curing， and significant correlations with chlorogenic acid and β-carotene were also observed. The negative correlations were observed between phenylalanine ammonia lyase activity and polyphenols and pigments， and the significant correlations with chlorogenic acid. Significant positive correlations were observed between peroxidase and lipoxygenase， phenylalanine ammonia lyase and polyphenol oxidase. Therefore， reasonable regulation of enzyme activities during air-curing can control the content of polyphenols and plastid pigments， which is beneficial to improvement of the curing characteristics of cigar.

cigar leaves; air-curing; polyphenols; plastid pigments; enzyme activities

雪茄烟是一种特殊的烟草制品，具有劲头大，焦油量少，香气丰满，对人体危害较小的特点。烟草调制是烟叶生产过程中的关键步骤，烟草中多酚類化合物在调制过程中通过酶促棕色化反应形成醌类等棕色色素使烟叶颜色转深，进而影响烟叶的色泽和香气。质体色素主要有叶绿素和类胡萝卜素，在调制过程中叶绿素未充分降解，会导致调制后烟叶的外观质量不良且内在品质不佳，类胡萝卜素降解产生的萜烯类物质以及叶绿素降解产生的新植二烯均是影响烟叶香气质量的重要化合物。因此，在烟草调制过程中，多酚类物质和质体色素的转化对烟叶外观质量和内在品质有着重要意义。王昇等研究表明，烟草中的多酚可以反映烟草的遗传特性和生长发育状态，并对烟草的颜色、烟气的质量和生理强度起着明显的作用，并且烟草中多酚含量与烟叶品质呈正相关。石盼盼等研究表明，烟草中类胡萝卜素的降解会形成多种香味物质，这些香味物质阈值相对较低、刺激性较小，对烟叶香气贡献率大。前人对调制过程中烤烟多酚类物质和质体色素变化规律及品质关系进行了大量研究，然而对于雪茄烟这一特色类型烟叶多酚类物质和质体色素的相关研究甚少。本文研究了不同部位雪茄烟叶在晾制过程中多酚类物质、质体色素含量及其相关酶活性的动态变化，旨在探讨雪茄烟叶中多酚类物质及质体色素在晾制过程中的降解机理，为调控雪茄烟叶中多酚类物质及质体色素含量提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验概况

试验于2018年在四川省什邡市师古镇大泉坑村雪茄烟叶生产基地进行，供试品种为德雪1号，试验田土壤pH值5.8～7.0，有机质含量3.01 g/kg，速效钾含量89 mg/kg，速效磷含量38.1 mg/kg，速效氮含量120 mg/kg，按照当地雪茄烟叶生产技术规范进行统一管理。

1.2  试验设计

采收时选取大田长势基本一致、叶片成熟度相对一致的烟株进行晾制，各部位采摘标准见表1。将采摘后的烟叶编杆挂入晾房（长×宽×高=16 m×20 m×6 m），挂杆长150 cm，杆距15 cm，每杆挂30～32片烟叶，避光晾制，参照邹宇航等的方法进行晾制过程中温湿度设定。雪茄烟叶晾制分为凋萎期、变褐期、定色期和干筋期4个时期，针对雪茄烟叶晾制的不同时期，对上、中、下3个部位烟叶在晾制第0、5、10、15和20 d进行取样，共取5次。每次选取外观相同的烟叶30片分成两份，一份取叶中部分用于生理指标的测定，另一份去除主脉、叶尖和叶基部杀青后用于多酚及色素的测定，各重复3次。

1.3  测定项目与方法

1.3.1  多酚类物质和质体色素含量测定  分别采用YC/T 202—2006和YC/T 382—2010的方法测定烟草中的多酚类物质和质体色素含量。

1.3.2  相关酶活性的测定  脂氧合酶（LOX）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）活性分别按照苏州科铭生物技术有限公司生产的相应酶试剂盒说明书方法进行测定。

1.4  数据分析

采用Excel进行作图及数据统计，利用SPSS 21.0对数据进行统计分析。

2  结  果

2.1  不同部位雪茄烟叶晾制过程中多酚类物质含量的变化

由表2可看出，不同部位雪茄烟叶在晾制过程中绿原酸含量变化规律相似，呈逐渐下降趋势，至20 d时达到最低值。在晾制过程中，下部叶绿原酸含量始终高于中部叶和上部叶，且与上部叶在0～10 d差异显著;在晾制结束时各部位绿原酸含量趋于一致。各部位芸香苷含量在晾制5 d内逐渐降低，随着晾制的进行，芸香苷含量稍有增加随后又逐渐减少。鲜叶中以中部叶的芸香苷含量最高（3.638 mg/g），其次为下部叶（3.235 mg/g）和上部叶（2.556 mg/g），并且在晾制5 d内3个部位芸香苷含量存在差异。各部位相比，以中部叶降解幅度最大為77.82%，其次为下部叶与上部叶分别为65.35%和43.58%。与绿原酸和芸香苷含量相比，烟叶内莨菪亭含量较低。在晾制开始时各部位叶片莨菪亭含量表现为中部叶>下部叶>上部叶，晾制结束时，各部位以中部叶莨菪亭降解量最大，其次为下部叶和上部叶，部位间的莨菪亭含量差异均不显著。

2.2  不同部位雪茄烟叶晾制过程中质体色素含量的变化

在晾制初期，烟叶质体色素中叶绿素a含量最高，叶黄素含量最低，各类色素随晾制过程的进行发生降解（图1）。不同部位叶绿素a含量在晾制的0～10 d降解速度较快，之后缓慢下降（图1a）。下部叶相比于中、上部叶在0～5 d内降解缓慢，之后趋势基本一致。晾制开始前各部位叶绿素a含量以上部叶最高下部叶最低，并且达到极显著差异（=0.007），这可能是由于上部叶晚熟并且在大田中接受阳光充足而有利于光合作用的进行。降解幅度以中部叶最大，其次是上部叶和下部叶，分别是96.56%、90.85%、90.48%。由图1b所示，叶绿素b含量变化趋势与叶绿素a基本一致，在5～10 d各部位降解速率最高，变褐期结束时（10 d）叶绿素b基本完全降解，之后趋于平缓。不同部位间叶绿素b含量差异均不显著（>0.05）。由图1c可看出，各部位雪茄烟晾制过程中β-胡萝卜素含量逐渐下降，在0～15 d降解速度略快，之后相对平缓。晾制初期β-胡萝卜素含量以上部叶最高，整个晾制过程中降解幅度表现为中部叶>下部叶>上部叶，但部位间β-胡萝卜素含量差异不显著（>0.05）。与叶绿素和β-胡萝卜素含量相比，烟叶中叶黄素含量最低（图1d），各部位在晾制过程中降解速度较均匀，除5 d时上部叶叶黄素含量与中、下部叶差异显著外（=0.034），其余时期各部位间差异不显著（>0.05）。

2.3  不同部位雪茄烟叶晾制过程中多酚、色素降解相关酶活性的变化

如图2a所示，不同部位的LOX活性在晾制期间具有相同的动态变化趋势，呈先上升后急剧下降的趋势。各部位烟叶LOX活性在10 d均达到了峰值并存在显著差异，此时的LOX活性表现为上部叶>中部叶>下部叶，分别为733.18、627.87、505.08 U/g，之后活性迅速下降;晾制结束时，3个部位LOX活性差异不显著。不同部位PPO活性变化规律趋于一致，呈现先升高后降低的趋势（图2b）。晾制后5 d，PPO活性最高，之后逐渐降低。除晾制开始时（0 d）各部位PPO活性无明显差异外，晾制过程中上部叶PPO活性始终大于中部叶和下部叶，且差异达到了显著水平。各部位雪茄烟叶PAL活性变化趋势基本相同，呈先升高后降低趋势（图2c）。在晾制过程中上、中、下3个部位烟叶PAL活性逐渐升高，在15 d达到峰值，比晾制开始时分别升高了71.88%、64.87%、50.29%，之后急剧下降。如图2d可知，不同部位间烟叶随着晾制过程的进展，POD活性呈现单峰波动趋势，在10 d达到峰值，此时表现为上部叶>中部叶>下部叶，且均达到显著性差异;在晾制15 d时，中部叶显著高于下部叶和上部叶;在晾制结束时，以中部叶下降幅度最大，其次是上部叶和下部叶，依次为88.73%、85.30%、79.18%。

2.4  不同部位雪茄烟叶晾制过程中多酚类物质和质体色素与相关酶的相关分析

脂氧合酶（LOX）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）与多酚类物质和质体色素代谢密切相关。如表3所示，POD与LOX、PPO、PAL均呈显著正相关，LOX与PPO在各部位均达到了显著正相关，而PAL与LOX和PPO关系不明显。LOX活性与莨菪亭、芸香苷以及质体色素含量呈正相关，但均未达到显著水平;PPO活性与多酚、色素含量呈正相关，尤其与绿原酸和β-胡萝卜素达到显著水平;在不同部位中PAL活性与多酚类物质和质体色素的含量呈负相关，尤其与绿原酸达到显著水平;各部位POD活性与类胡萝卜素呈正相关但未达到显著水平。

3  讨  论

多酚类化合物与质体色素是烟草中的重要物质，其含量直接影响调制后烟叶的色泽和外观质量。绿原酸、莨菪亭和芸香苷是烟草中主要的多酚类物质。柴家荣等研究表明，白肋烟TN86总酚含量随晾制的进行而下降，在3 d时含量较低，在6 d时稍有回升但仍比砍收时低，然后又逐渐下降。本试验结果表明雪茄烟具有相似规律，其中绿原酸含量呈下降趋势，且下降明显，莨菪亭和芸香苷含量表现为先下降后略有回升然后下降，这也与过伟民等的研究结果一致。不同部位比较，晾制初期雪茄烟叶绿原酸和芸香苷含量中部叶显著高于上部叶，随着晾制进行，差异逐渐减小，各部位莨菪亭含量在整个晾制过程中差异不显著。晾制期间下、中部叶3种多酚类物质含量高于上部叶，这与李力等研究略有不同，这可能是当地中、下部叶采收时期降雨量过大、气温低延迟采收造成的。

烟草中质体色素包括叶绿素和类胡萝卜素，其含量高低决定了烟叶调制后颜色的优劣，其降解产物对香气质和香气量有较大影响。刘晓迪等研究表明，烟叶类胡萝卜素在调制前期大量降解，在调制后期含量趋于稳定。本研究发现，雪茄烟叶各质体色素含量在晾制过程中变化规律基本相同，均呈下降趋势，且部位间表现为上部叶>中部叶>下部叶，这可能由于随着部位的升高，光照条件改善，光合作用增强有利于色素的合成，这与柴家荣等研究结果相似。但各质体色素降解幅度存在一定差异，叶绿素a降解幅度大于叶绿素b，β-胡萝卜素降解幅度大于叶黄素，且类胡萝卜素降解幅度远小于叶绿素，这说明晾制期间叶绿素含量的降解可能是调制后烟叶颜色变化的关键因素。

LOX是质体色素降解的关键酶，其活性可用来表示色素的降解速率。本試验结果表明，不同部位LOX活性在晾制期间呈先上升后下降的趋势，这可能由于随着晾制的进行，烟叶受到外界环境的胁迫，LOX活性升高，使烟叶内质体色素降解加快;而后期膜脂过氧化作用加剧，使细胞结构破坏，LOX活性下降^[22-23]，质体色素降解缓慢。PAL与多酚和色素都具有密切关系，可通过苯丙烷代谢途径形成酚类化合物和木质素。在晾制过程中PAL活性在不同部位间变化趋势基本一致，表现为前中期逐渐升高，后期急剧降低。这可能由于烟叶在晾制期间逐渐衰老使细胞膜通透性增大，自由基和过氧化物进入细胞，刺激细胞启动PAL防御机制来提高植物的抗逆性，晾制后期细胞膜被破坏，使PAL活性急剧降低。PAL与绿原酸达到了显著负相关，表明PAL与多酚类物质存在拮抗作用。PPO是呼吸链末端氧化酶，烟草在调制过程中可催化发生酶促棕色化反应。在晾制期间不同部位PPO呈现单峰趋势，在5 d达到峰值，此时也是芸香苷和莨菪亭含量的谷值，之后PPO活性逐渐下降而芸香苷和莨菪亭含量略有回升。PPO活性与酚类物质和色素含量存在显著正相关，因此雪茄烟叶在晾制过程中，可通过合理调控PPO活性，使多酚类物质转化有利于优质烟叶色泽的形成。POD是植物中重要的HO清除剂，能够预防细胞膜的损伤和酚类物质过度氧化发生的褐变。POD活性随着晾制的进行呈先增加后下降的趋势，且在整个晾制过程中活性保持在较高的水平，这样可以避免自由基积累过多，防止棕色化反应的过度发生，这与宋朝鹏等研究一致。相关分析表明，各部位POD与多酚类物质和质体色素关系不明显，但与LOX、PAL、PPO均达到显著正相关，说明多酚类物质和质体色素的降解是多种酶共同作用的结果。

等酶活性均表现为上部叶>中部叶>下部叶，可能是因为随着部位的升高叶片结构更紧密，内含物质增加，细胞抗氧化胁迫能力增强。

4  结  论

在晾制过程中，不同部位雪茄烟叶多酚类物质与质体色素含量总体降低;而LOX、PAL、PPO、POD等相关酶活性均呈先升后降的趋势，并且各部位酶活性均以上部叶最高，中部叶次之，下部叶最低;PPO活性与多酚、色素含量呈正相关，而PAL活性与多酚、色素的含量呈负相关，且POD与LOX、PAL、PPO均呈显著正相关，可以看出多酚与色素的降解是多种酶共同作用的结果。本试验研究多酚、色素与相关酶活性之间的关系，有助于通过合理的措施，调控调制期间雪茄烟叶的色泽和致香成分的变化，进而提高晾制后的烟叶质量，为优质雪茄烟叶的晾制提供了理论依据。

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