不同成熟度烤烟烘烤过程中游离氨基酸及转氨酶活性变化

陈颐　郑竹山　王建兵　陈若星　郑志云　孙书斌　邹聪明

摘  要：为明确不同成熟度烤烟烘烤过程中游离氨基酸组分转化规律，以烤烟品种K326为材料，对烟叶游离氨基酸组分含量及转氨酶活性进行了动态变化分析。结果表明，烟叶烘烤过程中，以谷氨酸等10种氨基酸含量和氨基酸总量变幅较大;不同成熟度烟叶中谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和天冬氨酸含量变化差异主要集中在变黄后期和定色前期，此时，适熟和过熟烟叶在烘烤中转氨酶活性较高;与尚熟烟叶相比，适熟和过熟烟叶丝氨酸、组氨酸酸、精氨酸和赖氨酸含量从烘烤定色期开始，呈现下降的变化，表明烟叶成熟度对游离氨基酸转化为美拉德产物有一定影响。由此，适当提高烟叶成熟度，有助于烟叶游离氨基酸互相转化和美拉德反应产物的生成。

关键词：烤烟;烘烤;成熟度;游离氨基酸;转氨酶

中图分类号：TS441          文章编号：1007-5119（2019）03-0075-09      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.011

In order to explore the transformation process of free amino acids in tobacco leaves with different maturity during the flue-curing process， we used flue-cured tobacco K326 in studying the content of free amino acids and transaminase activities. During the curing process of tobacco leaves， the contents of 10 species of amino acids such as glutamic acid and the total amount of amino acids showed significant changes. The differences in the contents of glutamic acid， alanine， phenylalanine， proline and aspartic acid in different maturity tobacco leaves were mainly observed at the late yellowing stage and the early leaf-drying stage. During these two stages of curing， proper-mature and over-mature tobacco leaves had higher transaminase activity. Compared with immature tobacco leaves， the contents of serine， histidine， arginine and lysine in the proper-mature and over-mature tobacco leaves showed a decreasing change starting from the leaf-drying stage， indicating that the maturity of tobacco leaves has a certain influence on the conversion of free amino acids into Maillard products. Properly increase of the maturity of tobacco leaves contributes to the mutual conversion of free amino acids and the formation of Maillard reaction products.

Keywords： flue-cured tobacco; flue-curing; maturity; free amino acid; transaminase

游離氨基酸是指以游离状态存在、未结合在蛋白质分子中的氨基酸，是烟草中含量最为丰富的一类重要的化学组分，它们不仅具有重要的生理功能，能调控烟叶内的能量代谢和物质转化，而且是烟叶香气的主要来源之一。烟叶内的游离氨基酸在成熟过程中，其含量和组分不断发生变化，而这些变化直接影响着烟叶的感官品质风格特色。烟叶成熟度不同，其游离氨基酸组分含量差异很大。因此，从烟叶采摘成熟度出发，通过合理调控密集烘烤参数促进烟叶内游离氨基酸组分转化，提高烟叶品质是现代烟叶烘烤的重要目标之一。目前，国内外烟草研究工作者围绕烘烤过程中烟叶游离氨基酸组分转化规律开展了大量研究。王爱华等从优化变黄期烘烤工艺入手研究了烘烤中烟叶游离氨基酸组分变化，结果表明变黄期阶梯升温烘烤工艺有利于蛋白质的降解及苯丙氨酸和酪氨酸的积累;谢良文等从有害物质氨和氢氰酸入手研究了与烘烤中游离氨基酸组分的关联，得出氢氰酸和氨在烘烤变黄后期到定色中期变化幅度较大;苏宇等从美拉德棕色化反应角度入手研究了烘烤中还原糖与游离氨基酸组分含量的关系，结果发现，在烟叶细胞死亡以及呼吸作用已经停止的条件下，氨基酸含量和还原糖含量仍然下降，说明氨基酸参与了非酶催化的美拉德反应，形成了具有烤香的美拉德反应产物。上述研究在烟叶烘烤游离氨基酸转化机理上研究不够全面。比如，烘烤中烟叶氨基酸的脱氨基作用研究甚少，绝大多数氨基酸脱氨基是出自转氨基反应，此反应属于“乒乓BiBi机制”，主要在转氨酶作用下进行。本研究采用以温度为依据取样和以时间为依据的取样两种试验模式，系统性研究不同成熟度烟叶密集烘烤中游离氨基酸组分含量、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和谷氨酸转氨酶的动态变化，为阐明烟叶烘烤游离氨基酸转化机理以及提高烟叶质量奠定理论及试验依据。

1  材料与方法

1.1  供試材料

试验①于2017年12月至2018年4月在云南省德宏州盈江县弄璋镇（东经97°52′，北纬24°36′，海拔816 m）进行;试验②于2018年4—9月于云南省玉溪市江川区九溪镇（东经102°38′，北纬24°18′，海拔1730 m）进行，供试品种均为K326，由玉溪中烟种子有限责任公司提供。本试验选取尚熟、适熟和过熟3种成熟度档次在田间采收中部鲜烟叶样品作为试验分析材料（表1）。

1.2  试验设计

不同成熟度处理的烟叶采摘、编竿，确保烟叶部位均衡一致，在当地密集烤房中进行烘烤。试验①烘烤工艺主要依据德宏烟区主推烘烤模式进行;试验②烘烤工艺主要依据玉溪烟区主推烘烤模式进行。密集烘烤过程中取样设计如下：

①德宏烘烤以烘烤温度为依据取样：在整个烘烤过程中所有处理的关键恒温点34 ℃、36 ℃、38 ℃、42 ℃、46 ℃、48 ℃、52 ℃、56 ℃、60 ℃进行取样，干冰保存，并放入−80℃低温冰箱待用，加上烤前（背景值）共计取样10次，各处理分别编成3竿烟同炉烘烤，每次每竿选取有代表性的叶片5片作为1次重复，每处理共15片。②玉溪烘烤以烘烤时间为依据取样：在整个烘烤过程中所有处理每12小时取样1次，干冰保存，并放入−80 ℃低温冰箱待用，加上烤前（背景值）共计取样13次，各处理分别编成3竿烟同炉烘烤，每次每竿选取有代表性的叶片5片作为1次重复，每处理共15片。

1.3  测定方法

游离氨基酸组分含量：采用PITC柱前衍生化的HPLC技术测定。所用仪器Waters e2695高效液相色谱仪（美国waters公司）。游离氨基酸组分含量变化幅度的计算方法：每种氨基酸在相邻两次取样间的变化幅度⊿按下式计算：

式中：表示任一温度或时间样品的氨基酸含量;表示下一次取样样品的氨基酸含量。谷氨酸转氨酶（Glutamic transaminase）活性、天冬氨酸转氨酶（Aspartate transaminase）和丙氨酸转氨酶（Alanine transaminase）活性：采用ELLISA法用谷氨酸转氨酶联免疫分析测定试剂盒（武汉伊艾博科技有限公司）进行测定。所用仪器为SpectraMax 190光吸收型酶标仪（美国Molecular Devices公司），AC8洗板机（Thermo Labsystems）。

1.4  数据统计

数据均采用EXCEL 2016和SPSS 22.0分析软件进行方差分析、计算和统计作图表。

2  结  果

2.1  烘烤过程中烟叶游离氨基酸组分描述性统计

由表2可以看出，烘烤过程中不同阶段烟叶游离氨基酸组分差异很大，其中天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸、赖氨酸和氨基酸总量变异系数超过60%，属于重度变异，且标准差大于1，天冬氨酸、

谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和丝氨酸指标的偏度和峰度小于−1或者大于1，样本内变异已经不符合正态分布，表明天冬氨酸等10种氨基酸和氨基酸总量在烘烤过程中波动和变幅较大。

2.2  烘烤过程中烟叶游离氨基酸组分含量变化

根据烘烤过程中烟叶游离氨基酸组分的描述性统计结果，选用波动和变幅较大的10种氨基酸进行分析，由表3和表4可知，在密集烘烤过程中，不同成熟度烟叶游离氨基酸总量和组分含量的变化差异很大，其中尚熟烟叶游离氨基酸组分含量均增加，而适熟和过熟烟叶组分含量有增有减。依据烘烤过程中适熟和过熟烟叶游离氨基酸组分含量变化趋势，可以分为4类：第1类游离氨基酸组分含量表现为“升高-下降-升高”;第2类游离氨基酸组分含量表现为“升高-下降”;第3类游离氨基酸组分含量表现为“下降-升高”;第4类游离氨基酸组分含量表现为一直下降。烘烤完成后，第1类游离氨基酸组分含量较烤前增加，而第2类、第3类和第4类游离氨基酸组分含量则较烤前减少。

第1、2类游离氨基酸，不同成熟度烟叶谷氨酸在烘烤时间72～96 h以及烘烤温度42～48 ℃，脯氨酸在烘烤时间0～48 h以及烘烤温度25～38 ℃，总氨基酸在烘烤时间24～84 h以及烘烤温度36～46 ℃，组氨酸和丝氨酸在烘烤时间36～72 h以及烘烤温度36～42 ℃，含量增加幅度均存在极显著性差异（<0.01）。其中尚熟烟叶谷氨酸、脯氨酸、氨基酸总量、组氨酸和丝氨酸含量增幅较快。

第3类游离氨基酸，不同成熟度烟叶丙氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸在烘烤时间48～84 h以及烘烤温度38～46 ℃，含量变化幅度均存在极显著性差异（<0.01）。其中过熟和适熟烟叶丙氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸含量在烘烤过程中变黄后期（烘烤时间48～72 h和烘烤温度38～42 ℃）降幅较大，而尚熟烟叶在烘烤定色前期（烘烤时间72～84 h和烘烤温度42～46 ℃）增幅较大。

第4类游离氨基酸，不同成熟度烟叶天冬氨酸在烘烤时间48～72 h以及烘烤温度38～42 ℃，赖氨酸和精氨酸在烘烤时间24～48 h以及烘烤温度36～38 ℃，含量下降幅度均存在极显著性差异（<0.01）。其中过熟和适熟烟叶天冬氨酸含量在烘烤过程中变黄后期（烘烤时间48～72 h和烘烤温度38～42 ℃）降幅较大，而赖氨酸和精氨酸含量在烘烤变黄中期（烘烤时间24～48 h和烘烤温度36～38 ℃）降幅较大。表明不同成熟度烟叶游离氨基酸组分变化差异主要集中在变黄期和定色前期（烘烤时间24～84 h和烘烤温度36～46 ℃）。

2.3  烘烤过程中煙叶转氨酶活性的变化

由图1、图2和图3可知，在密集烘烤过程中，各处理烟叶天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和谷氨酸转氨酶活性变化趋势基本一致，呈现“上升-下降”的变化。其中以时间为取样依据的烘烤，波峰均出现在烘烤第72 h，酶活分别为703.57、811.54和174.55 ng/g;而以温度为取样依据的烘烤，波峰均出现在烘烤42 ℃，酶活力分别为584.63、686.06和160.43 ng/g。表明烘烤烟叶转氨酶活性较高的时期主要表现在变黄后期和定色前期。不同成熟度烟叶天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和谷氨酸转氨酶活性在烘烤时间60 h、72 h和84 h以及烘烤温度38 ℃、42 ℃和46 ℃均存在极显著性差异（<0.01），其中过熟和适熟烟叶转氨酶活性均极显著高于尚熟烟叶，表明过熟和适熟烟叶在烘烤变黄后期和定色前期更有利于游离氨基酸组分相互转化。

3  讨  论

烘烤中游离氨基酸的转化利用相当复杂，目前认为主要有3种途径：一种是脱氨基作用，又可以分为转氨基作用和氧化脱氨基作用，前者将氨基酸脱下氨基转移到α-酮酸上形成新的氨基酸，

后者将氨基酸分解转变为氨气和α-酮酸，第二种途径是通过脱羧基作用，将氨基酸分解为CO和胺，第三种与还原糖发生非酶棕色化反应生成美拉德产物，赋予烟气香味，其中转氨基作用和美拉德反应在烟叶烘烤中为主要转化方式。本试验分别采用以温度为依据取样和以时间为依据取样，系统研究了不同成熟度烟叶在烘烤过程中，氨基酸组分含量和天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和谷氨酸转氨酶活性的动态变化，结果表明，以温度为依据取样和以时间为依据取样所获得的氨基酸组分含量

和相关转氨酶活性的动态变化分析结果基本相似。这说明在烤烟品种、成熟度已知的条件下，无论是采取“时间取样模式”，还是“温度取样模式”进行烟叶内氨基酸组分及酶活性的分析都可以获得较好的研究结果。但在烘烤试验取样时，应注意将温度或时间与烘烤工艺的变黄期、定色期和干筋期相对应。

谢良文等研究结果将烘烤过程中游离氨基酸组分含量变化分为4类，分别是“下降-上升”、“下降-平稳”、“上升-下降”和“基本不变”4种变化形式。本研究在不同成熟度烟叶在烘烤过程中，共检测出18种氨基酸，其中以谷氨酸、脯氨酸、组氨酸等10种氨基酸和氨基酸总量波动和变幅较大，也将其分为4类，其中第2类游离氨基酸组分丝氨酸和组氨酸含量表现为“升高-下降”，第4类游离氨基酸组分赖氨酸和精氨酸含量表现为一直下降，共同特点是从烘烤定色期（烘烤时间72 h和烘烤温度42 ℃）开始，各类氨基酸出现显著下降趋势，这可能与还原糖发生非酶棕色化反应生成美拉德产物有关，这与过伟民等研究结果相似。ASHOOR等^[22]依据美拉德反应的程度将氨基酸的反应活性划分为高、中、低3档，高活性的氨基酸多为碱性（组氨酸、赖氨酸和精氨酸），低活性氨基酸多为酸性，脯氨酸和丝氨酸属于中等活性，其含量占总量的40%～70%，因此，在烘烤定色期和干筋期，高活性和中等活性氨基酸含量降幅越大，其美拉德反应越剧烈。

转氨酶是催化游离氨基酸组分转化的关键酶，其活性高低直接影响着L-氨基酸与α-酮酸的转氨速率，一般转氨反应都是可逆的。本试验结果表明，与尚熟烟叶相比，适熟和过熟烟叶在烘烤变黄后期和定色前期（烘烤时间60～84 h和烘烤温度38～46 ℃）天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和谷氨酸转氨酶活性较高，此时，第1类游离氨基酸中的谷氨酸、第3类游离氨基酸中的丙氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸、第4类游离氨基酸中的天冬氨酸在烘烤中变黄后期和定色前期变幅较大（烘烤时间48～84 h和烘烤温度38～46 ℃），这可能是由于转氨酶在植物中各时期分布和活性有很大差异，适熟和过熟烟叶处于衰老进程的后期，在烘烤逆境环境胁迫下，其酶活性表现出较高的活性。本文只初步、定量分析了不同成熟度烟叶游离氨基酸组分相互转化以及相关酶活动态变化规律，烟叶的烘烤是一个化学反应复杂的酶活变化体系，进一步研究不同成熟度烟叶的游离氨基酸组分与转氨酶活性的对应关系，制定更为科学、合理的烘烤工艺曲线标准，将能进一步提升烟叶烘烤品质，更符合不同卷烟企业原料的需求。

4  结  论

密集烘烤过程中，烟叶中谷氨酸、脯氨酸、组氨酸等10种氨基酸和氨基酸总量波动和变幅较大。不同成熟度烟叶中谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和天冬氨酸含量差异主要集中在变黄后期和定色前期（烘烤时间48～84 h和烘烤温度38～46 ℃），此时，适熟和过熟烟叶在烘烤中天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶与谷氨酸转氨酶活性较高。与尚熟烟叶相比，适熟和过熟烟叶丝氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸含量从烘烤定色期（烘烤时间72 h和烘烤温度42 ℃）开始，呈现下降的变化趋势，表明烟叶成熟度对游离氨基酸转化为美拉德产物有一定影响。由本试验研究结果可知提高烟叶成熟度有利于氨基酸组分的互相转化以及美拉德产物生成，为后续烟叶成熟采收和烘烤工艺优化提供了重要理论基础和试验依据。

参考文献

董洪旭，李小兰，奚家勤，等. 不同香型产区烤烟游离氨基酸含量及组成差异分析[J]. 烟草科技，2017，50（3）：15-22.

DONG H X， LI X L， XI J Q， et al. Free amino acid content and composition correlations in flue-cured tobacco from different planting areas and different flavor types[J]. Tobacco Science & Technology， 2017， 50（3）： 15-22.

邓国宾，曾晓鹰，薛红芬，等. 烤烟游离氨基酸与感官质量的相关性研究[J]. 中国烟草科学，2011，32（5）：14-23.

DENG G B， ZENG X Y， XUE H F， et al. Correlation between free amino acids and sensory quality of flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2011， 32（5）： 14-23.

王树声，王宝华，李雪震，等. 烤烟烟叶中游离氨基酸与内在质量关系的研究[J]. 中国烟草科学，2002，（4）：4-7.

WANG S S， WANG B H， LI X Z， et al. Relationship between content of free amino acids and inherent quality of flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2002， （4）： 4-7.

崔慶伟，田栾栾，路晓崇，等. 烤烟烘烤过程中主要含氮化合物与烟气氨释放量的相关性研究[J]. 江西农业学报，2012，24（9）：95-97.

CUI Q W， TIAN L L， LU X C， et al. Study on correlation between main nitrogen compounds and flue gas ammonia emission of flue-cured tobacco in baking process[J]. Acta Agriculturae Jiangxi， 2012， 24（9）： 95-97.

刘荣森，张长水，李建娥，等. 烤烟成熟进程中游离氨基酸含量的变化[J]. 河南农业大学学报（自然科学版），2001，35（2）：152-15.

LIU R S， ZHANG C S， LI J E， et al. Changes of free amino acid content in the process of flue-cured tobacco ripening[J]. Journal Of Hunan Agricultural University （Natural Sciences）， 2001， 35（2）： 152-15.

王爱华，王松峰，孙福山，等. 变黄期阶梯升温烘烤工艺对多酚类及相关物质的影响[J]. 中国烟草科学，2016，37（2）：59-64.

WANG A H， WANG S F， SUN F S， et al. Effects of the step-temperature yellowing curing technology on polyphenol and related substance in tobacco leaves[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（2）： 59-64.

王爱华，王松峰，许永幸，等. 变黄温度对烟叶密集烘烤过程中香气物质和氨基酸含量的影响[J]. 中国烟草科学，2014，35（3）：67-71.

WNAG A H， WANG S F， XU Y X， et al. Effects of different yellowing temperatures on aroma constituents and amino acid contents of tobacco leaves during bulk curing process[J]. Chinese Tobacco Science， 2014， 35（3）： 67-71.

谢良文，路晓崇，裴晓东，等. 烤烟烘烤过程中氨基酸含量变化对主要含氮化合物的影响[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版），2016，42（2）：152-156.

XIE L W， LU X C， PEI X D， et al. Effect of amino acid content on main nitrogen-containing compounds of flue-cured tobacco in the process of curing[J]. Journal of Hunan Agricultural University （Natural Sciences）， 2016， 42（2）： 152-156.

苏宇. 烟叶成熟、烘烤及醇化过程中游离氨基酸及主要化学成分分析[D]. 长沙：湖南农业大学，2016.

SUN Y. Analysis of free amino acids and main chemical components in tobacco leaves during maturity curing and aging process[D]. Changsha： Hunan Agricultural University， 2016.

PERCUDANI R， PERACCHI A. A genomic overview of pyridoxal-phosphate-dependent enzymes[J]. Embo Reports， 2003， 4（9）： 850-854.

PHILLIPS R S. Chemistry and diversity of pyridoxal-5’-phosphate dependent enzymes[J]. Biochimica Et Biophysica Acta， 2015， 1854（9）： 1167-1174.

李东，孙家义. 2，4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法测定18种氨基酸[J]. 化学分析计量，2004，13（1）：18-20.

LI D， SUN J Y. Determination of 18 kinds of amino acids by high performance liquid chromatography with 2，4-dinitrofluorobenzene pre-column derivatization[J]. Chemical Analysis， 2004， 13（1）： 18-20.

陳颐，杨佳玫，王玉平，等. 不同产地片烟醇化进程中抗氧化物质动态变化分析[J]. 中国烟草科学，2017，38（5）：93-99.

CHEN Y， YANG J M， WANG Y P， et al. Dynamic variation analysis of antioxidant substances in flue-cured tobacco strips from different producing areas during aging[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（5）： 93-99.

张迪，惠希武，曹卫荣，等. ELISA法测定微生物谷氨酰胺转氨酶残留量[J]. 药物分析杂志，2018，38（1）：124-129.

ZHANG D， HUI X W， CAO W R， et al. Determination of residual microbial transglutaminase by ELISA[J]. Chinese Journal Pharmaceutical Analysis， 2018， 38（1）： 124-129.

王镜岩. 生物化学下册[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2005.

WANG J Y. Biochemistry， volume II[M]. 3rd edition. Beijing： Higher Education Press， 2005.

赵会纳，谢已书，李章海，等. 不同成熟度烟叶在散叶烘烤过程中主要化学成分的动态变化[J]. 湖北农业科学，2013，52（4）：835-839.

ZHAO H N， XIE Y S， LI Z H， et al. Dynamic changes of major chemical components in tobacco leaf of different maturity during loose leaves baking process[J]. Hubei Agricultural Sciences， 2013， 52（4）： 835-839.

宋朝鹏，徐成龙，宫长荣，等. 烘烤过程中烤烟不同类型游离氨基酸含量变化及对卷烟氨释放量影响[J]. 东北农业大学学报，2013，44（7）：132-136.

SONG C P， XU C L， GONG C R， et al. Different types of free amino acids content changes in flue-curing process and impact of cigarette ammonia emission[J]. Journal of Northeast Agricultural University， 2013， 44（7）： 132-136.

王旭，冯涛，庄海宁，等. 氨基酸对美拉德反应产物呈香特性的研究进展[J]. 中国调味品，2013，38（7）：1-5.

WANG X， FENG T， ZHUANG H N， et al. The research progress of amino acids on aroma characteristics of maillard reaction products[J]. China Condiment， 2013， 38（7）： 1-5.

王能如，徐增汉，李章海，等. 烘烤和变黄后期变黄程度对烟叶中游离氨基酸含量的影响[J]. 安徽农业科学，2007，35（7）：1955-1956.

WANG N R， XU Z H， LI Z H， et al. Effect of flue-curing and yellowing degree at later yellowing stage on the contents of free amino acids in the cured leaf[J]. Journal Of Anhui Agriculture， 2007， 35（7）： 1955-1956.

董洪旭，周芸，黄善松，等. 烤烟游离氨基酸区域性差异及其与外观品质关系[J]. 西南农业学报，2017，30（4）：937-944.

DONG H X， ZHOU Y， HUANG S S， et al. Regional differences of free amino acids and relationship between free amino acid and appearance quality of flue-cured tobacco[J]. Southwest China Journal Of Agricultural Sciences， 2017， 30（4）： 937-944.

過伟民，郭建华，董洪旭，等. 烤烟游离氨基酸与感官品质的关联及烘烤过程的变化规律研究[J]. 中国烟草学报，2018，24（6）：25-29.

GUO W M， GUO J H， DONG H X， et al. Correlation between free amino acids and smoking quality of flue-cured tobacco and variations during flue-curing process[J]. Chinese Tobacco Journal， 2018， 24（6）： 25-29.

ASHOOR S H， ZENT J B. Maillard browning of common amion acids and sugars[J]. Journal of Food Science， 1984， 49（4）： 1206-1207.

贺帆，王涛，王站义，等. 变黄期不同温湿度对烘烤中烟叶蛋白质降解及酶活性的影响[J]. 中国烟草学报，2014，20（5）：80-85.

HE F， WANG T， WNAG Z Y， et al. Effects of temperature and humility on protein degradation and related enzyme activities in tobacco leaf in yellowing stage[J]. Chinese Tobacco Journal， 2014， 20（5）： 80-85.

TAO L， ZHOU H， GUO X S， et al. Contribution of exopeptidases to formation of nonprotein nitrogen during ensiling of alfalfa[J]. Journal Of Dairy Science， 2011， 94（8）： 3928-3935.