贵州烟田植物白粉病病原菌鉴定分析

陈兴江　汪汉成　向立刚　崔梦娇　周浩　代园凤　陈雪

摘  要：为了解烟草白粉病菌在贵州烟区的寄主植物种类，采集烟田植物白粉病样品，基于真菌rDNA-ITS区的序列分析对其白粉病菌进行分子生物学鉴定，采用柯赫氏法则回接验证。结果表明，贵州烟区共发现18科36种不同植物感染白粉病，其中菊科苣荬菜、向日葵、苦苣菜及大丽花，车前科车前草，及玄参科阿拉伯婆婆纳的白粉病病原菌均为，与烟草白粉病病原菌（）相同，其余30种植物白粉病病原菌与烟草白粉病菌均不相同;接种后，阿拉伯婆婆纳、车前草及苦苣菜在培养30 d内均发生白粉病，苣荬菜、向日葵、大丽花等33种植物均未发病。因此，阿拉伯婆婆纳、车前草及苦苣菜3种植物可明确为烟草白粉病菌在贵州烟区的寄主植物。

关键词：二孢白粉菌;分子鉴定;烟草;寄主植物

中图分类号：S435.72          文章编号：1007-5119（2019）03-0055-05      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.008

This study was conducted to investigate the host plants of the tobacco powdery mildew pathogen in Guizhou tobacco-growing field. Plant tissues with typical powdery mildew symptoms were sampled， pathogens of these hosts were identified by molecular method through analyzing the rDNA-ITS gene of the pathogens， and host plants of the  tobacco powdery mildew pathogen were identified by Koch's postulates. The results showed that a total of 36 plant species in 18 different families showed typical powdery mildew symptoms. Among them， the pathogens of powdery mildew in plant species Linn.， L.， L.， Cav.， and were all ， the powdery mildew pathogen  of ， which is not the pathogens of the other 30 plant species. After inoculating with on host plants， tobacco， ， and all showed typical powdery mildew symptoms during a 30 days’ incubation period， while the other 33 plant species did not. In summary， hosts of from tobacco in Guizhou tobacco-growing filed included ， and .

; molecular identification; tobacco; host plant

煙草（L.）是我国重要的经济作物，其在生产过程中极易受到烟草白粉病（tobacco powdery mildew）的危害。烟草白粉病是烟草生长中后期普遍发生、且危害严重的叶部真菌病害，可侵染烟草叶片、茎、叶柄、花梗、蒴果等多个部位，导致烟叶失去烘烤价值，造成烟叶产量和质量下降，给烟农造成严重经济损失。了解烟草白粉病病原菌来源和寄主范围，对指导烟草种植和烟草白粉病的防治均具有重要作用。

烟草白粉病属于典型气传真菌性病害，喜中温中湿环境，在烤烟生产季节，极易发生与流行。该病害由子囊菌亚门（Ascomycotina），核菌纲（Pyrenomycetes），白粉菌属（）的二孢白粉菌（）引起。除危害烟草外，还能侵染菊科（Asteraceae）、葫芦科（Cueurbitaceae）等多种作物。在贵州烟田周围，二孢白粉菌的寄主包括大丽花（ Cav.）、苦苣菜（ L.）等。然而，局部烟区这些植物并不常见，而烟草白粉病依然频繁发生。烟草白粉病菌的初侵染源除源自闭囊壳释放的子囊孢子外，还可能来自其他植物上二孢白粉菌的粉孢子。据笔者调查发现，烟田周边多种植物在烟草生育期前后也严重发生白粉病。这些植物是否为二孢白粉菌的转主寄主目前还不清楚。为此，本文对烟田周边植物白粉病病原菌进行分子生物学鉴定，并对鉴定为二孢白粉菌的植物进行烟草白粉菌回接验证，旨在明确烟草白粉病菌在贵州烟区的寄主范围。现将研究结果报道如下。

1  材料与方法

1.1  供试病原菌与试剂

烟草白粉病菌（）由贵州省烟草科学研究院微生物实验室提供，将其长期保存于温室大棚的活体烟草植株叶片上，温度范围为20～28 ℃，相对湿度大于70%，自然光照条件。保存品种为云烟87，该品种为当地烤烟主栽品种。真菌基因组DNA提取试剂盒（Code：D304）、TaKaRa Ex Taq（Code：DRR001A）、DL2000TM DNA Maker（Code：B6301A），均购自宝生物工程（大连）有限公司;真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），均由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.2  白粉病菌样本采集

于2017年3—11月，采集贵州省毕节市、贵阳市烟田及其周边感染白粉病植物的叶片，将其分别装于无菌采样袋中，依次编号，4 ℃保存，并迅速带回贵州省烟草科学研究院微生物实验室，用于分子生物学鉴定。

1.3  白粉病菌分子生物学鉴定

选取1.2中植物感病叶片上白粉病的单个病斑，以其粉孢子为对象，参照宝生物工程（大连）有限公司试剂盒（Code：D304）的说明裂解其粉孢子，获得其基因组DNA。以各病原菌DNA为模板，采用引物ITS1和ITS4对各病原菌的rDNA-ITS区进行PCR扩增。扩增条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环;最终72 ℃延伸10 min。采用1.0%琼脂糖电泳检测PCR产物，并送上海生工生物工程技术有限公司测序。测序结果在GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中进行BLAST对比分析，并在NCBI数据库中登录各病原菌的基因序列信息。

1.4  烟草白粉菌寄主植物鉴定

依据柯郝氏法则进行回接鉴定。采集1.2中植物的健康叶片，将叶片从基部剪下，洗净、晾干。用无菌水保湿的脱脂棉包住叶片茎基部，将植株叶片置于带有沥水板的保鲜盒内（29 cm×15 cm×6 cm），在盒内加入适量的无菌水保湿，采用孢子抖落接菌法接种烟草白粉病菌（），每种植物接种4张叶片。接菌后将植物叶片置于温度范围20～28 ℃、相对湿度大于70%、自然光照下的玻璃温室中培养，9～30 d后观察各植物叶片白粉病的发生情况，并参照1.3的方法采集发病叶片单个孢子堆白粉病菌样品，进行分子生物学鉴定。

2  结  果

2.1  贵州烟田感染白粉病植物

烟草生长季节前后，在贵州省毕节市和贵阳市烟田发现36种植物感染白粉病（表1），采集各植物白粉病单孢子堆样品。其中，菊科植物14種，包括苣荬菜（ Linn.）、薇甘菊（ Kunth）、向日葵（ L.）、苦苣菜（）、小蓬草（ L.）、蒲公英（Hand.-Mazz.）、鳢肠（ L.）、牛膝菊（ Cav.）、豨莶草（L.）、大丽花（）等;葫芦科植物4种，包括南瓜（ （Duch. ex Lam.） Duch. ex Poiret）、葫芦（（Molina） Standl.）、甜瓜（ L.）;茄科植物2种，包括烤烟（ L.）和番茄（ Mill.）;小檗科植物2种，包括紫叶小檗（var. atropurpurea Chenault）和十大功劳（（Lindl.）Fedde）;豆科植物2种，包括三叶草（ L.）和黄豆（ （Linn.） Merr.）;其他植物13种，分别属于车前科、凤仙花科、蔷薇科、大戟科、唇形科、旋花科、蓼科、伞形科、苏木科、禾本科、玄参科、马桑科、及杜鹃花科（表1）。

2.2  白粉病菌分子生物学鉴定

烟田周边植物白粉病菌rDNA-ITS区PCR扩增均获得500 bp左右的片段，经GenBank数据库BLAST对比发现，除铁苋草白粉病菌外，所有植物白粉病菌的同源性达93%以上。分子生物学鉴定结果表明，菊科植物鳢肠、牛膝菊、豨莶草、百日菊、翅果菊和藿香蓟，及3种葫芦科植物的白粉病病原菌均为;苣荬菜、向日葵、苦苣菜、大丽花、车前科植物车前草、及玄参科植物阿拉伯婆婆纳的白粉病病原菌均为;小蓬草和蒲公英的白粉病病原菌均为;薇甘菊的白粉病病原菌为;金鸡菊的为（表1）。其余植物白粉病菌的病原菌鉴定结果如表1所示。将各植物白粉病菌扩增获得的rDNA-ITS区序列提交NCBI，获得基因登录号如表1所示。

2.3  二孢白粉菌（）寄主植物鉴定结果

烟田周边36种植物叶片经过烟草白粉病菌（）接菌培养结果表明，阿拉伯婆婆纳、车前草、苦苣菜的叶片上均产生白色霉层，出现典型的白粉病症状;苣荬菜、大丽花及其余测试植物叶片上均未出现白粉病症状。挑取发病植物叶片上白粉病单个孢子堆，进行分子生物学鉴定，结果表明，所鉴定病原菌均为。根据上述结果，确定阿拉伯婆婆纳、车前草、苦苣菜3种植物为烟草白粉病菌的寄主植物。

3  讨  论

烟草白粉病严重威胁着烟草的生产，生产上可采用多种杀菌剂进行该病害的防治。本文通过系统调查、分子鉴定、回接验证等分析，初步明确了贵州烟区烟草白粉病寄主植物种类，对了解烟草白粉病的初侵染来源和指导烟草白粉病的防治具有重要意义。

白粉病菌的鉴定通常需要结合病原菌的形态学和分子生物学特征，本文仅采用了分子生物学的手段对病原菌进行了鉴定，下一步研究中，有待通过镜检完善烟田周边植物白粉病菌的形态学特征。植物白粉病菌的分子生物学鉴定通常基于真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）的序列分析。本研究中，大部分植物白粉病菌被鉴定到种，包括、等;然而，部分病原菌所测ITS区与其近源种的同源性较低，如：、、等。这可能与这些植物的白粉病菌在ITS区的保守性较低有关。此外，本文对少部分植物白粉病菌基于ITS的鉴定结果与文献报道的病原菌种类并不完全一致，这可能与测序结果在进行Blast同源性比较时结果的选择有关，也可能是寄主植物存在其他新的未见报道的白粉病病原菌。随着基因组学的发展，基于多基因的病原微生物的鉴定技术正在被开发应用，然而，

白粉病菌这方面的研究还未见报道，下一步有待筛选白粉病菌的特异性引物，将其用于多种植物白粉病的鉴定。

据报道，烟草白粉病菌除为害烟草外，还能侵染胡萝卜科、茄科、菊科、蔷薇科、豆科和旋花科等115个属以上的植物，本研究仅发现6种植物的白粉病菌与其相同，这可能与本地区感白粉病植物种类的区域分布局限性有关，同时也可能与采样时间有关，下一步有待增加采样范围和种类，特别是采集烟草生长季节之外时期感染白粉病植株样品，并对其病原菌进行鉴定。本文采集到的36种植物白粉病样品中，大部分寄主属菊科植物，发现菊科植物间的白粉病菌并不相同;此外，其余17科植物的白粉病菌间也存在较大差异。这可能与同一区域植物的白粉病菌在环境中存在着丰富的多样性有关。研究发现菊科植物苣荬菜和苦苣菜的白粉病菌均被鉴定为，与烟草白粉病菌的病原菌相同，但柯赫氏法则回接验证时，苣荬菜在培养期内并未发病，其原因目前并不清楚，有待下一步深入研究。大丽花和向日葵培养期内未观察到发病，可能与培养时间不够有关，有待继续观察。此外，本研究发现3种植物为贵州烟区的烟草白粉病病原菌的寄主，在今后本地区烟草生产和烟草白粉病的防治过程中，需要关注烟田周边植物车前草、阿拉伯婆婆纳、苦苣菜上白粉病的发生时期，做好烟草白粉病发生的预测预报工作，同时对这些植物上的白粉病也应进行综合防治。

4  结  论

贵州省毕节市、贵阳市烟田及其周边18科36种感染白粉病植物中，菊科苣荬菜、向日葵、苦苣菜及大丽花，车前科车前草，及玄参科阿拉伯婆婆纳的白粉病病原菌均為，与烟草白粉病病原菌（）相同，其余30种植物白粉病病原菌与烟草白粉病菌均不相同;接种烟草白粉病菌后，阿拉伯婆婆纳、车前草及苦

苣菜在培养30 d内均发生白粉病，苣荬菜、向日葵、大丽花等33种植物均未发病。为此，阿拉伯婆婆纳、车前草及苦苣菜3种植物可明确为烟草白粉病菌在贵州烟区的寄主植物。

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