香玲核桃组培的褐化观察

何九军 张少飞 赵淑玲

摘要 通过组织培养香玲核桃，对不同时间中核桃苗的褐化现象进行观察，并提出了影响其褐化现象的一些因素。结果表明，初代培养采用改良DKW为基础培养基，添加1 g/L活性炭，核桃外植体用0.1%升汞消毒2 min后，褐化率最低。

关键词 核桃;组织培养;褐化;观察

中图分类号：S664.1 文献标识码：A 文章编号：2095-3305（2019）04-005-02

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2019.04.002

Abstract The browning phenomena of walnut seedlings at different time were observed by tissue culture，and some factors affecting the browning were put forward. The results showed that the browning rate of walnut explants was the lowest when they were disinfected with 0.1% mercury for 2 minutes on the basis of modified DKW medium and 1 g/L activated carbon.

Key words   Walnut;Tissue culture;Browning;Observation

核桃是食疗佳果，含有大量脂肪和蛋白质极易被人体吸收，其中蛋白质中含有对人体极为重要的赖氨酸，对大脑神经的营养极为有益。核桃具有独特的滋补、营养、保健作用，常吃核桃不仅能滋养血脉，增进食欲，乌黑须发，而且还能医治性功能减退、神经衰弱、记忆衰退、肾结石及润肠通便等;对骨骼系统有益处，有防癌、防辐射作用，经常使用电脑者更视其为保健护肤的佳品;具有抗衰老作用，可以从多方面保护心血管系统，能预防心脑血管疾病。

褐变是由组织中的酚类物质经多酚氧化酶（PPO）氧化后产生棕褐色的醌类物质造成的[1]。外植体褐变是核桃苗褐变的主要方面，一般外植体褐变的发生受多因子影响。刘淑兰[2]在核桃组培试验中发现，培养基中无机盐含量和激素浓度、培养温度、外植体自身生理状态等都与褐变程度有关，较高培养温度（25±2）℃、培养基中较高无机盐浓度、较高激素浓度及木质化程度高的外植体都会促进褐化的发生。张小红等[3]以香玲核桃休眠芽和新生枝芽茎段作为试材进行褐化研究，发现嫩枝茎芽的褐化死亡率显著高于休眠芽和半木质化茎芽，不但褐化死亡率较低，而且腋芽萌发率显著高于休眠芽。由此可见，不同芽位的外植体因木质化程度及其代谢活动存在着差异，在培养过程中褐化程度也不一样。此外，外植体的大小及伤害程度也是影响褐变发生的因素之一。另外，接种时各种消毒剂对外植体的伤害也会引起褐化。张建成等[4]研究认为，新改良的DKW培养基上的核桃试管芽苗较改良DKW培养基生长健壮，增殖率高;核桃试管芽苗继代增殖的最适pH为6.2;变温培养（光照期25℃±3℃，黑暗期18℃±2℃）较恒温培养（25℃±3℃）适于核桃试管芽苗的继代增殖。笔者通过组培观察了核桃苗褐变的过程，并提出了影响核桃苗褐变的一些因素。

1 材料与方法

1.1 试验材料

香玲核桃在甘肃成县核桃科技示范园采集。试验仪器有烧杯、天平、灭过菌的培养皿、剪刀、滤纸、酒精灯、计时器、纱布、托盘、锥形瓶、废液罐、一次性手套、玻璃棒、镊子、超净工作台（上海跃进医疗器械有限公司）、LDZX？鄄50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。试验试剂有6？鄄BA、IBA、IAA、无菌水、酒精（75%）、升汞、注射用青霉素钠（哈药集团）、蔗糖（天津市永大化学试剂有限公司）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、琼脂粉、抗坏血酸（天津市大茂化学试剂厂）。

1.2 试验过程

试验用改良DKW作为诱导培养基，琼脂8 g/L，蔗糖30 g/L，按表1培养基配制称取基本培养基、激素（6？鄄BA、IAA、IBA）、抗褐化剂（聚乙烯吡咯烷酮，PVP）、抗生素（青霉素），待琼脂完全溶解后调pH为中性，用50 ml三角瓶进行分装;分别标记为H1、H5与H6，不同配方培养基分别制作30瓶，核桃茎段外植体先用自來水流水冲洗10～14 h，再分别用0.1%升汞消毒0.5、1、2 min后接入锥形瓶。

分别用不同的吸附剂VC、PVP、Na2S2O3、活性炭添加在DKW培养基中，用流水冲洗的核桃茎段作外植体，0.1%升汞消毒2 min，分别植入添加有VC、PVP、Na2S2O3、活性炭等吸附剂的锥形瓶中，每一吸附剂制作培养基30瓶。

按以上方法得到的锥形瓶，放于陇南师范高等专科学校农林技术学院植物组织培养室，培养条件为温度20～25℃，12 h光照。每天观察记录，统计褐化、污染及新芽的发生。

1.3 观察并记录

在核桃组织培养中，外植体的褐化现象较为普遍[4]，有不少学者采用添加不同剂量的活性炭管、Na2S2O3、VC、PVP等抑制褐化现象，取得较好的效果[5-7]。经过前期试验准备，确定每升培养基中添加2 g PVP和0.5 g VC。在12、72、144 h时观察并记录H1、H5、H6 培养基上核桃苗的褐化现象（图1～3）。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方式和培养基对核桃苗褐化的影响

从图1可以看出，核桃外植体的褐化在第1次观察（12 h）就有发生，随时间的推移，褐化现象会进一步加强，轻度是外植体底部与培养基接触面发生褐化，到后期整个外植体以及培养基均发生褐化（图2～3）。

用0.1%的升汞处理外植体，处理时间分别是0.5、1、2 min，发现不同的消毒方式H1、H5、H6 3种培养基上的表现不同，褐化率不同，其中H5培养基的褐化率较为稳定，保持在50%左右，H6培养基的褐化率较高，在升汞消毒0.5 min条件下，褐化率达到70%。H6培养基在升汞消毒2 min处理下，褐化率得到抑制，控制在30%以内，说明升汞的处理时间和褐化率有一定的相关性。

由图4可知，3种培养基中，H6培养基中的核桃苗褐化最少，褐化率不到40%，可见H6（改良的DKW+6-BA 10 g/ml+IAA 50 g/ml+PVP+抗生素）的培养基褐化最好。

2.2 不同吸附剂对核桃苗褐化的影响

核桃的褐化问题一直受到很多学者的关注，用不同的吸附剂，如VC、PVP、Na2S2O3、活性炭等可以在一定程度上抑制褐化。由表2可知，用不同吸附剂处理的外植体，其褐化率表现不同，VC、PVP、Na2S2O3、活性炭的褐化率分别是30.0%、16.7%、20.0%和13.3%，可以看出这几种吸附剂对褐化都有一定的抑制，在DKW培养基上，VC处理的褐化率最高，活性炭处理的褐化率最低，表明DKW培养基中添加活性炭对核桃外植体的褐化现象有较好的抑制作用。

3 结论与讨论

陇南是核桃的原产区，从20世纪国家实行退耕还林以及当地政府采用多种方式栽种经济林以来，成县以独特的气候地理优势成为核桃的优势栽培区，核桃也成为当地农民的重要经济来源之一。优良品质的核桃一直是人们的需要。通过植物组织培养的方式获得优质的核桃苗，可以为当地的扶贫助力。

升汞是植物组织培养中常用的消毒剂[8]，核桃近端用0.1%升汞分别消毒0.5、1、2 min，在不同的培养基上抑制褐化的效果不同，其中以H6（改良的DKW+6？鄄BA 10 g/ml+IAA 50 g/ml+PVP+抗生素）培养基的褐化抑制效果最好。

木本植物在组织培养中，褐化的抑制是初代培养的关键点。褐化的发生因植物的种类、外植体和培养基的类型不同而不同[9]，一般普遍认为褐化的发生是植物体内多酚氧化酶（PPO）与酚类物质相互作用引起的[10]。对褐化的防治，可以在培养基中添加吸附剂、抗氧化剂、活性炭[11]。该试验中，核桃外植体用VC、PVP、Na2S2O3、活性炭4种不同的吸附剂及抗氧化剂进行防治褐化，发现这几种吸附剂对褐化都有一定的抑制，VC、PVP、Na2S2O3、活性炭的褐化率分别是30.0%、16.7%、20.0%和13.3%，在DKW培养基上，VC处理的褐化率最高，活性炭处理的褐化率最低。

褐化的原因多种多样，外植体、消毒、培养基等都有可能引起褐化。该试验中初代培养采用改良DKW为基础培养基，添加1 g/L活性炭，核桃外植体用0.1%升汞消毒2 min后，褐化率最低。如何将褐化控制到最低，还需要进一步研究。

参考文献

[1] 姚红军，罗晓芳，田砚亭. 植物组织培养褐变的研究进展[J]. 北京林业大学学报，1999，21（3）： 78-84.

[2] 刘淑兰.‘薄壳香’核桃组培中的褐化及防止措施研究[J].园艺学报，2009，29 （2）： 171-172.

[3] 张小红，代侃韧，马兆平，等. 核桃离体培养中外植体褐化的研究[J]. 陕西林业科技，2005（4）：7-9.

[4] 刘兰英.‘薄壳香’核桃组培中的褐化及防止措施研究[J]. 园艺学报，2002，29（2）：171-172.

[5] 王杨洋，于海洋. 核桃楸組织培养技术研究[J]. 防护林科技，2017（12）：13-14.

[6] 张卫芳，高疆生，欧勇慧，等. 抑制核桃组培中的褐化现象初探[J]. 落叶果树，2003，35（3）：4-7.

[7] 张卫芳，高疆生，欧勇慧，等.核桃组培中抑制褐化现象初探[J]. 中国农学通报，2003，19（5）：43-43.

[8] 胡文斌，张少飞，孙娜，等. 核桃组培过程中的污染和褐化研究及防治策略[J]. 农业灾害研究，2017，7（3）：59-60.

[9] 冯代弟，王燕，陈剑平. 植物组培褐化发生机制的研究进展[J]. 浙江农业学报，2015，27（6）：1108-1116.

[10] SALTVIL M E.Wound induced changes in phenolic metabolism and tissue brow？鄄ning are altered by heat shock[J]. Postarwest Biology and Technology，2000，21（1）：61-69.

[11] 郭艳，杨海玲. 植物组织培养中的褐化现象及解决途径[J]. 山西农业科学，2009（7）：14-16.

责任编辑：郑丹丹