SDX抑制NLRP3炎症小体激活以减轻糖尿病视网膜微血管渗漏

李静仁 李婷 何学敏 周丽 唐喜香 陈燕铭

【摘要】 目的 探討舒洛地特（SDX）治疗糖尿病视网膜病变的可能性及分子机制。方法 将40只C57BL/6J小鼠随机分成4组各10只，分别为对照+生理盐水（Con + NS）组、对照+舒洛地特（Con + SDX）组、糖尿病+生理盐水（DM+NS）组和DM + SDX组，SDX的用量为腹腔注射10 mg/（kg·d）、持续12周，对照给予等量生理盐水。采用高糖（25 mmol/L葡萄糖）处理人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）以模拟糖尿病刺激，并与一系列浓度的SDX（0.125、0.25、0.5、1.0 lsu/ml）共处理。用伊文思蓝法检测小鼠视网膜的渗漏情况，用蛋白免疫印迹法、激光共聚焦等技术检测小鼠视网膜组织和HRMEC中的核苷酸结合寡聚域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体的表达和激活情况，以及凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、Caspase-1的变化。结果 DM + NS组伊文思蓝吸光度、NLRP3炎症小体及ASC的表达均较Con + NS组高，而DM + SDX组则低于DM + NS组（P均< 0.05）。SDX抑制糖尿病小鼠视网膜渗漏、NLRP3炎症小体激活和视网膜微血管渗漏。HRMEC的NLRP3炎症小体组分和cleaved Caspase-1在高糖刺激下表达上调（P均< 0.05）;经不同浓度的SDX处理后，NLRP3炎症小体的表达被抑制，抑制程度随SDX浓度的增加而增加（P均< 0.05）。结论 舒洛地特能抑制糖尿病诱导的NLRP3炎症小体激活和视网膜微血管渗漏，可用于治疗糖尿病视网膜病。

【关键词】 舒洛地特;糖尿病视网膜病变;核苷酸结合寡聚域样受体蛋白3炎症小体;

    微血管渗漏;人视网膜微血管内皮细胞

Sulodexide alleviates retinal microvascular leakage by inhibiting the activation of NLRP3 inflamm-asome in diabetic retinopathy Li Jingren， Li Ting， He Xuemin， Zhou Li， Tang Xixiang， Chen Yanming. Department of Endocrinology & Metabolism， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Chen Yanming

【Abstract】 Objective To investigate the feasibility and molecular mechanism of sulodexide in the treatment of diabetic retinopathy.  Methods Forty C57BL/6J mice were randomly into the control + normal saline （Con + NS group）， control + sulodexide （Con + SDX group）， diabetes mellitus + normal saline （DM + NS group） and diabetes mellitus + sulodexide groups （DM + SDX group）. Sulodexide was intraperitoneal injected at a dose of 10 mg/（kg·d） for 12 weeks， and an equivalent quantity of phosphate buffer saline （PBS） was given in the control group. Human retinal microvascular endothelium cells （HRMECs） were stressed by high glucose （25 mmol/L） to mimic the diabetic conditions， and co-treated with a serial doses of sulodexide （0.125， 0.25， 0.5 and 1.0 lsu/ml）. The mouse retinal vascular leakage was evaluated by the Evans blue assay. The expression and activation of nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor protein 3 （NLRP3） inflammasome in the retinal tissues and HRMEC of mouse models， and the changes of the apoptosis-associated speckle-like protein containing CARD （ASC） and caspase-1 were measured by Western blot and laser confocal imaging， etc.  Results The absorbance value of Evans blue assay and the expression levels of NLRP3 inflammasome and ASC in the DM + NS group were significantly higher compared with those in the Con + NS group， whereas the values in the DM + SDX group were considerably lower than those in the DM + NS group （all P < 0.05）. Sulodexide significantly inhibited the increased retinal leakage， the activation of NLRP3 inflammasome and attenuated the retinal vascular leakage in mouse models. The expression levels of NLRP3， Caspase-1 and cleaved Caspase-1 of HRMEC were significantly up-regulated under the condition of high glucose （all P < 0.05）. After treatment with different concentrations of sulodexide， the expression levels of NLRP3 and ASC were significantly down-regulated in a dose-dependent manner （both P < 0.05）.  Conclusion Sulodexide can inhibit the DM-induced activation of NLRP3 inflammasome and retinal microvascular leakage， which can be applied to treat diabetic retinopathy.

【Key words】 Sulodexide;Diabetic retinopathy;

Nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome;

Microvascular leakage;Retinal microvascular endothelial cell

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病严重的微血管并发症之一[1]。视网膜血管内皮功能紊乱在DR的发病中起重要作用[2-3]。核苷酸结合寡聚域样受体蛋白3（NLRP3）属于核苷酸结合寡聚域样受体（NLR）家族，其与细胞凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和Caspase-1的前体蛋白组合形成NLRP3炎症小体，激活下游炎症通路[4]。近期研究显示，NLRP3炎症小体在糖尿病小鼠的视网膜和高糖刺激的人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）中均处于激活状态[5-6]，提示NLRP3炎症小体可能参与了高血糖导致视网膜血管内皮功能紊乱的过程。舒洛地特（SDX）属于糖胺聚糖，由低分子肝素和硫酸皮肤素组成[7]。多项研究表明，SDX有内皮细胞保护作用。我们课题组的前期研究显示，SDX可阻碍高血糖引起HRMEC的p-NF-κB p6及炎症因子TNF-α、人单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）升高[8]。但SDX是否通过抑制NLRP3炎症小体的激活和表达来改善DR的视网膜微血管内皮功能仍有待探讨。

材料与方法

一、主要材料与试剂

HRMEC购自美国Sciencell公司。链脲佐菌素（STZ，S0130）、D-葡萄糖（G7021）、伊文思蓝（EB，E2129）粉末购自美国Sigma公司;SDX由意大利阿尔法韦士曼制药公司惠赠;NLRP3抗体（AG-20B-0014-C100）、ASC抗体（AG-25B-0006 -C100）购自瑞士Adipogen公司;pro-Caspase-1 +

p10 + p12抗体（ab179515）、Caspase-1抗体（ab 1872）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔二抗（ab97051）、Alexa Fluor® 488偶联的兔荧光二抗（ab150077）、Alexa Fluor® 647偶联的小鼠荧光二抗（ab150115）、含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的固封剂（ab104139） 购自英国Abcam公司;β-actin抗体（A5441）购自美国Sigma公司;HRP标记的小鼠二抗（7076P2）购自美国 Cell Signaling Technology公司。

二、动物模型的分组、建立和处理

C57BL/6小鼠购自广东省医学实验动物中心。C57BL/6J小鼠40只，将其随机分成4组各10只，

分别为对照+生理盐水（Con + NS）组，对照+

SDX  （Con + SDX）组，糖尿病+生理鹽水（DM+ NS）组和DM + SDX组。糖尿病模型是基于60%高脂食物喂养6周后予以单次腹腔注射STZ（100 mg/kg）而建立[9]。处理1周后小鼠血糖值高于16.7 mmol/L的则为糖尿病建模成功。Con + SDX组与DM + SDX组均连续12周腹腔注射SDX 10 mg/（kg·d）;Con + NS组与DM + NS组则注射等量生理盐水。本研究经中山大学实验动物管理与使用委员会批准。

三、EB法检测血管通透性

腹腔注射1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉小鼠，从其尾静脉注射EB 50 mg/kg后将其置于37℃热毯上2 h，使EB循环全身。取其右侧眼球置于4%多聚甲醛中，室温固定30 min，而后将视网膜铺片，在激光共聚焦显微镜上用405 mm波长拍摄视网膜微血管渗漏情况。摘取小鼠右侧眼球后用37℃磷酸盐缓冲液（PBS）灌注其心脏2 min，然后摘取左侧眼球，取视网膜组织置于150 μl甲酰胺中，用超声裂解，之后将其置于70℃水浴18 h，1 200转/分离心30 min后取上清，用620 mm波长检测其吸光度值[10]。

四、眼球冰冻切片

麻醉小鼠及用PBS灌注心脏操作如上述，之后取其眼球置于OCT胶中包埋，置于干冰上迅速固定。于冰冻切片机中切片，并置于-80℃保存。

五、免疫荧光染色

将眼球切片放置于室温15 min晾干，之后将其浸泡于磷酸盐吐温缓冲液（PBST）中洗去OCT胶;将接种于玻底培养皿的细胞用PBST浸洗3次，每次5 min。用4%多聚甲醛室温固定切片或细胞10 min，用PBST浸洗3次，每次5 min。将0.2% TritonX-100溶于1% BSA溶液中，破膜1 h，用PBST浸洗3次，每次5 min。加入NLRP3抗体（1∶200）、ASC抗体（1∶200）、Caspase-1抗体（1：200），放置于湿盒中4℃过夜，然后用PBST浸洗3次，每次5 min。加入带荧光的二抗，放置于湿盒中室温孵育1 h，之后用PBST浸洗3次，每次5 min。加入含DAPI的固封剂封片。在激光共聚焦相应波长上拍摄对应蛋白的表达情况和位置分布。

六、细胞培养

以1×105细胞/孔将HRMEC种于6孔板上（6组）。在细胞完全贴壁后，加入2 ml的PBS洗涤3次，第1组给予低糖培养基（完全ECM培养基含5 mmol/L葡萄糖），第2 ～ 6组给予高糖培养基（完全ECM培养基含25 mmol/L葡萄糖），第3 ～ 6组分别加入不同浓度度的SDX （0.125、0.25、0.5、1.0 lsu/ml）。每24 h换1次培养液， 48 h后收集细胞进行蛋白免疫荧光染色检测其中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达情况。

七、统计学处理

采用SPSS 20.0 进行统计学分析。实验重复3次及以上，计量资料以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、SDX减轻DM小鼠视网膜渗漏

Con+NS组、Con+SDX组视网膜微血管EB渗漏情况无差异，DM+NS组视网膜微血管EB渗漏较Con+NS组明显，DM+SDX组视网膜微血管EB渗漏情况优于DM+NS组，见图1A。

EB的定量检测结果显示，DM+NS组、DM+ SDX组视网膜微血管EB渗漏量均高于其余2组（F = 34.890，P < 0.001），但DM+SDX组视网膜微血管EB渗漏量少于DM+NS组（P < 0.05）。

二、SDX减轻高糖诱导的NLRP3炎症小体在HRMEC中的表达增加

高糖组NLRP3炎症小体成分较低糖组高，加入1.0 lsu/ml的SDX处理后，NLRP3炎症小体相关蛋白表达下调，抑制程度随SDX浓度的增加而增加（P均< 0.05），见图2。

三、SDX降低糖尿病小鼠视网膜和高糖诱导的HRMEC中的NLRP3炎症小体的表达和激活

糖尿病小鼠NLRP3炎症小体激活增加，注射SDX后NLRP3、ASC和Caspase-1的表达和共定位相对注射生理盐水的小鼠均有所减少，见图3A、 B。

高糖刺激的HRMEC中NLRP3炎症小体激活增加，加入SDX处理后，NLRP3、ASC和Caspase-1的表达和共定位减少。

讨 论

DR作为糖尿病常见的微血管并发症之一，已成为成人致盲的首要疾病[11]。我国2013年的研究调查显示，成年人群的糖尿病患病率为10.4%，其中DR的发病率高达23.0%[12-13]。了解DR的发病机制，寻找无创、有效的治疗手段对于治疗因为DR导致的成年人失明具有极其重要的意义。糖胺聚糖是人体中含量最丰富的多糖，由重复的二糖片段构成，主要分布在细胞外基质或细胞的表面，可以为细胞提供支撑。SDX属于糖胺聚糖，多项临床和基础研究证实SDX具有内皮细胞保护作用[7， 14-16]。我们课题组前期的研究显示，SDX对高糖诱导的HRMEC功能紊乱具有保护作用，可以减轻高糖导致的炎症反应[8]。本研究结果显示，在DM + NS组小鼠的视网膜微血管中，EB渗漏情况严重，而DM + SDX组几乎未见渗漏，表明SDX改善了糖尿病引起的视网膜微血管渗漏情况。另外，视网膜组织裂解液中的EB的吸光度检测结果也表明SDX可以减轻糖尿病小鼠视网膜的渗漏。

研究显示，NLRP3炎症小体的激活在糖尿病小鼠的视网膜和高糖刺激的HRMEC中均上调[5-6， 17]。在内皮细胞中高糖诱导的氧化应激可以导致NLRP3炎症小体的激活，并参与DR的发病[18-20]。本研究显示，在糖尿病小鼠的视网膜和高糖处理后的HRMEC中，NLRP3炎症小体成分的表达和激活均有上调，这提示NLRP3炎症小体在DR的发病過程中起重要作用。NLRP3炎症小体的激活可以将Caspase-1切割为cleaved Caspase-1，本研究中高糖处理与低糖处理后的HRMEC中Caspase-1的表达比较差异无统计学意义，可能是由于上调的Caspase-1蛋白被切割为cleaved Caspase-1所致。

Giurdanella等[21]发现SDX可以通过下调NF-κB的激活来下调HRMEC中的ERK/cPLA2/COX-2/PGE2通路，改善HRMEC在高糖处理后的紧密连接蛋白减少。我们课题组的前期研究也进一步佐证了上述发现，即SDX下调HRMEC中的NF-κB磷酸化，从而减轻HRMEC的炎症反应[8]。又有报道证实NLRP3炎症小体的激活受PGE2调控[6]。因此，关于SDX如何抑制NLRP3炎症小体的表达和活化，我们推测：SDX可能通过降低NF-κB的磷酸化，阻碍ERK/cPLA2/COX-2/PGE2通路，减少NLRP3炎症小体组分的表达与激活，减轻DR的炎症反应。

综上所述，本研究首次在小鼠体内证实了SDX改善了DR视网膜微血管渗漏和视网膜的NLRP3炎症小体的表达及活化，为SDX应用于临床治疗DR提供了进一步的证据。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-04-29）

（本文編辑：洪悦民）