桑叶中生物碱提取工艺的优化和功能活性研究

叶甜 谢翰祥 严喜鸾

摘 要：目的：优化桑叶生物碱超声辅助提取法工艺，同时探究桑叶生物碱在降血脂血糖方面的作用。方法：利用单因素试验分别优化超声提取工艺中的提取试剂比例、提取时间、提取温度和提取次数，然后利用最优组合得到桑叶生物碱提取物，以此灌胃小鼠4周后，收集小鼠血液，利用试剂盒测定小鼠血脂和血糖含量。单因素试验结果显示：找到桑叶生物碱的最佳提取试剂比例、提取时间、提取温度和提取次数分别为70%乙醇、20min、50℃和2次。血糖血脂实验结果显示：和正常对照组相比，灌胃高剂量桑叶生物碱4周能使小鼠血液中的TC、TG含量分别显著下降19.40%、17.32.% （P<0.05），空腹血糖水平显著下降9.19%（P<0.05）。结论：当用70%乙醇在50℃条件下提取桑叶中生物碱20min，并提取2次时，可使生物碱得率最高。桑叶生物碱具有较好的预防高血脂、高血糖效果。

关键词：桑叶;生物碱;提取工艺;降血糖;降血脂

中国是世界上的种植大国之一，有着悠久的农耕文明。小麦、水稻、大豆、花生、玉米等多种农作物都是我国重要的经济作物，除了粮食型种植业外，还有其他许多生产型种植业，例如茶叶、桑蚕业、果蔬等。其中，种桑养蚕在我国的农业生产中占据着重要地位，早在几千年前，我国就已经开始了桑蚕业的生产发展。我国的桑树种类丰富，种植面积大，产量高，桑树所产的桑叶多用于养蚕业，但是由于养蚕所需的桑叶数量远远低于其产量，导致了大量的桑叶资源浪费[1-3]。现代化学分析手段显示，桑叶中含有丰富的黄酮、多糖、生物碱、多酚、矿物质等成分，能在抗炎症、抑制肿瘤转移、降血压血糖等方面为人类健康保驾护航[4-5]。为此，有诸多学者在桑叶的保健功能及相关产品的开发方面进行了许多研究和探索，希望能够在一定程度上解决人类的健康问题，同时进一步提升桑叶的商业价值，实现更大的经济效益。目前，关于桑叶中生物碱的研究是一个热点。生物碱在桑叶中有着较高的含量，特殊的多羟基结构使得它具有许多生理功能，生物碱的含量高低是衡量桑叶质量好坏的一个重要指标[6-8]。关于生物碱的提取方法主要为热浸提法、超声或微波辅助提取法，前者具有加热温度高、时间长的缺陷，后者相对改善了这些缺点，是目前最常用的提取方法[9-10]。本研究在单因素试验的基础上，分别探究最佳的提取试剂比例、提取时间、提取温度和提取次数，寻找这些单因素之间的最优组合;然后以此条件进行桑叶中生物碱的提取，探究生物碱的降糖降脂效果，为桑叶保健品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑叶，湖北省中药材公司，品种为胜利大叶;1-脱氧野尻霉素标准品（DNJ），北京德威钠生物技术有限公司，纯度为色谱级;40只4周龄昆明种清洁级雄鼠（体重20±2g）和基础饲料、高脂饲料，重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司;总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血糖测定用试剂盒，南京建成生物工程研究所;乙腈，天津四友化工试剂厂;其他所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

2010型高效液相色谱仪，日本岛津公司;超声清洗仪，天津赛恩斯科学仪器有限公司;M680型酶标仪，美国伯乐公司;H2500R-2型冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物碱含量的测定 配置标准溶液：准确称量10.0mg DNJ标准品于10mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，得到浓度为1.0mg/mL的标准储备液。分别吸取1、2、3、4、5mL标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，得到浓度为100、200、300、400、500μg/mL的系列标准工作液。参照文献[11]和[12]中DNJ的衍生方法和色谱条件设置，测定标准曲线。以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到的曲线方程为y=4 452.3x-215 93 （R2=0.999 4）。提取液中生物碱含量测定：在上述测定条件下测得样品的峰面积，代入到标准曲线中计算出样品溶液的生物碱浓度。

1.3.2 单因素试验设计 用清水将桑叶清洗干净，晾干，用粉碎机进行粉碎，过60目筛。准确称取50g桑叶粉末，分别以50%、60%、70%、80%、90%的乙醇為提取试剂，向桑叶中加入100mL，在800W功率、40℃条件下超声提取30min，提取2次，合并滤液，旋蒸浓缩至5mL左右，利用高效液相色谱法测定提取液中生物碱含量。关于提取时间的单因素试验设计，以上述最佳比例为提取试剂，分别设置提取时间为10、20、30、40min，其余条件同上。关于提取温度的单因素试验设计，以最佳比例和时间为提取条件，分别设置提取温度为30、40、50、60℃，其余条件同上。关于提取次数的单因素试验设计，以最佳比例、提取时间和温度为条件，分别设置提取次数为1、2、3、4次，其余条件同上。

1.3.3 桑叶生物碱的制备 在确定了桑叶生物碱的最佳提取试剂、提取时间、提取温度和提取次数后，称取适量的桑叶粉末于该条件下进行超声提取，制备生物碱提取液，浓缩后冻干成粉末，用于后续实验操作。

1.3.4 生物碱的降糖降脂作用实验 动物饲养：对购买的40只小鼠用基础饲料适应性喂养1周，随机平均分成4组，分别为正常对照组，生物碱低、中、高剂量组。分别按照50、100、200mg/kg·BW的剂量对小鼠进行灌胃操作，同时正常对照组小鼠灌胃等体积的生理盐水。灌胃持续4周，灌胃期间饲喂高脂饲料。实验期间，小鼠每周称重2次并记录，小鼠饲养环境条件符合相关规定。

血样采集：灌胃结束后，对小鼠采取禁食不禁水措施，然后进行眼眶取血，所得血液放于含有肝素钠的离心管中，并做低温离心操作，4 000 r/min离心15 min，收集上层血清用于测定TC、TG和血糖含量。利用酶联免疫吸附法进行测定，相关操作按照试剂盒中附带的说明书进行。

1.4 数据处理

测定结果用±s表示。采用SPSS 19.0对数据进行显著性分析，P<0.05认为差异有显著性。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的乙醇对提取桑叶生物碱效果的影响

由图1可知，利用醇提法提取桑叶中的生物碱时，乙醇的浓度对生物碱的得率有较大的影响（P<0.05）。随着乙醇浓度的增加，生物碱的提取率呈现上升后下降的趋势，当用70%的乙醇作为提取溶剂时，生物碱的得率最高，此时为85%。因此，可以确定用醇提法提取生物碱时的最佳提取试剂是70%乙醇。

2.2 提取时间对桑叶生物碱提取效果的影响

由图2可知，随着提取时间的延长，生物碱的提取率呈增加趋势，但是增加趋势逐渐变缓，幅度减小。提取时间为10～20min之间时，提取率增加明显，之后增加比较平缓。考虑到实验的效率性，将最佳提取时间定为20min。

2.3 提取温度对桑叶生物碱提取效果的影响

由图3可知，随着提取温度的升高，提取率会上升，但之后会下降。可能是因为当温度较高时，生物碱中的某些成分稳定性下降，从而使得提取率下降。

2.4 提取次数对桑叶生物碱提取效果的影响

由图4可知，随着提取次数的增加，生物碱的提取率会逐渐增加。但是当次数为3次或4次时，提取率增加幅度并不明显，基本上提取2次后，便可将桑叶中的生物碱提取完全。因此，生物碱的最佳提取次数为2次。

2.5 桑叶生物碱降血脂效果

目前，高血脂是严重危害人类健康的一个因素，高血脂症已成为一个普遍现象。血液中的TG和胆固醇含量需要维持在一个正常水平，才不会对机体健康造成威胁[13-15]。但是当脂肪摄入过多时，机体消耗的脂肪低于摄入的脂肪，就会造成脂肪蓄积，最直接的结果就是血脂升高，对脂代谢造成负担[16-18]。由表1可知，与正常对照组相比，桑叶生物碱处理有助于降低血脂水平。对于TC来说，高剂量生物碱可以使其含量显著下降19.40%（P<0.05），中、低剂量可分别使TC下降8.96%、2.99%，不具有显著性（P>0.05）;对于TG来说，高、中剂量生物碱可以使其含量分别显著下降17.32%、13.41%（P<0.05），低剂量可下降4.47%，不具有显著性（P>0.05）。可见，桑叶生物碱具有预防高脂血症的作用，适量生物碱可以降低血液中TG和胆固醇的含量。

2.6 桑叶生物碱降血糖效果

空腹血糖指隔夜空腹、采食早餐前测定的血糖值，能够反映基础胰岛素的分泌功能，在糖尿病的监测中是一个重要指标[19-21]。正常的血糖值是一个范围，当超过上限的某一程度时就会被判定为糖尿病，控制血糖水平在正常水平是保证机体健康的重要举措之一[22-23]。由表2可知，与正常对照组相比，桑叶生物碱处理能够在一定程度上降低血糖水平。高剂量生物碱可以使空腹血糖含量显著下降9.19%（P<0.05），中、低剂量可分别使血糖下降5.07%、0.94%，不具有显著性（P>0.05）。可见，桑叶生物碱具有预防血糖升高的作用，适量生物碱可以降低血糖水平，减少机体的糖代谢负担。

3 讨论

目前关于桑叶生物碱的降糖降脂研究较少，本研究对其在降糖降脂方面的作用做了一个初步探究，并对它的提取工艺进行优化。结果显示，当使用超声辅助提取法时，用70%乙醇在50℃条件下提取桑叶中生物碱20min，并提取2次时，可使生物碱得率最高。关于桑叶生物碱的降糖降脂作用研究显示，一定量的桑叶生物碱可以降低血液中TG和胆固醇含量，说明它具有较好的预防高血脂作用，这和仝义超[12]的研究结果一致。同时还能够降低空腹血糖值，还能够预防血糖升高，杨旭等[4]的研究结果同样显示桑叶生物碱对缓解糖尿病有效果。

综上所述，桑叶生物碱的最佳提取工艺为70%乙醇、50℃条件下提取20min，提取2次。桑叶生物碱具有一定的预防高血脂和高血糖的作用，这有助于进一步开发桑叶的保健和药用价值，提升桑叶的经济效益。本研究只是初步探索了桑叶生物碱的降糖降脂作用，但对于作用机制目前还不明晰，后续需要更深入的研究。

参考文献

[1]王嬰，王岩，吴新荣，等.桑叶生物碱提取工艺研究进展[J].广东化工，2014，41（19）：94-94.

[2]桑叶生物碱的检测提取及含量分析[D].重庆：西南大学，2016.

[3]贺胜，周杏子，何海，等.响应面法优化桑叶总生物碱超声提取工艺[J].中国药房，2015（25）：3537-3540.

[4]杨旭.桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究[D].南京：南京理工大学，2012.

[5]李平平.桑叶生物碱的变化规律及其降血糖作用研究[D].广州：华南农业大学，2011.

[6]刘一衡，杨玲.正交设计优化新疆药桑桑叶总生物碱超声提取工艺[J].食品工业科技，2013，34（24）：306-308.

[7]蒋小飞，赵忠启，张宪党.桑叶中生物碱脱氧野尻霉素（DNJ）的最佳提取工艺探讨[J].西昌学院学报（自然科学版），2010，24（4）：50-52.

[8]李凡，裘雅渔，钱文春，等.桑叶中总生物碱和1-脱氧野尻霉素的含量考察[J].中国药学杂志，2008，43（3）：176-179.

[9]蒲俊松.桑叶生物碱的检测提取及含量分析[D].重庆：西南大学，2016.

[10]刘凡，李平平，廖森泰，等.98份不同桑树品种资源的桑叶总生物碱及1-脱氧野尻霉素含量测定[J].蚕业科学，2012，38（2）：185-191.

[11]刘韦鋆，赵骏，曾森，等.桑叶总生物碱中1-脱氧野尻霉素的测定及方法学考察[J].天津中医药，2010，27（2）：166-168.

[12]仝义超.桑叶降血糖降血脂研究及其产品开发[D].杭州：浙江工商大学，2010.

[13]李君.桑叶降血糖有效部位提取工艺优化及桑叶原料质量标准研究[D].南京：南京中医药大学，2015.

[14]冯亮.布渣叶总生物碱降血脂作用机制研究[J].辽宁医学院学报，2015，36（5）：15-18.

[15]石琳，劉楠，杨平.荷叶中生物碱对昆明小鼠减肥降脂作用的研究[J].农产品加工（学刊），2013（9）：9-10.

[16]侯宏，孙胜亮，黄静，等.黄连生物碱抗高脂血症及动脉粥样硬化实验研究[J].时珍国医国药，2011，22（10）：2462-2464.

[17]吴洪丽，郝瑜，周洪英，等.桑树生物碱研究进展[J].北方蚕业，2016，37（4）：1-5.

[18]刘凡，廖森泰，李平平，等.桑叶总生物碱降血糖活性研究[C].广东省食品学会第六次会员大会暨学术研讨会论文集，2012.

[19]陈新，黄静，李盼盼，等.黄连生物碱对糖尿病小鼠降糖和氧化应激作用研究[J].亚太传统医药，2012，8（4）：24-25.

[20]杨旭.桑叶中总生物碱提取工艺优化及降血糖活性研究[D].南京：南京理工大学，2012.

[21]赵骏，高岚，齐召朋.荷叶总生物碱及其盐的提取和降脂作用的比较[J].天津中医药，2005，22（2）：161-162.

[22]胡瑞君，车振明，徐丹，等.微波辅助提取桑叶生物碱DNJ的工艺研究[J].食品科技，2007，32（8）：139-141.

[23]徐冰，刘泉，刘率男.桑叶总生物碱的抗糖尿病活性研究[J].中药材，2015，38（5）：1024-1026.

Abstract：Objective To optimize the extraction process of mulberry leaf alkaloids by ultrasound-assisted extraction，and to explore the role of mulberry leaf alkaloids in lowering blood lipid and blood sugar.Method Single factor experiments were used to optimize the proportion of extraction reagents，extraction time，extraction temperature and extraction times，and then the best combination was used to obtain the alkaloid extract of mulberry leaves.After 4 weeks of intragastric administration，the blood of mice was collected and the blood lipid and blood sugar content of mice were determined by kits.Result The results of single factor experiment showed that the optimum ratio of extraction reagents，extraction time，extraction temperature and extraction times were 70% ethanol，20 min，50℃ and 2 times，respectively.The results of blood glucose and lipid test showed that compared with the normal control group，the TC and TG contents in blood of mice were significantly decreased by 19.40% and 17.32% after 4 weeks of administration of high-dose mulberry leaf alkaloids （P<0.05），and the fasting blood glucose level was significantly decreased by 9.19% （P<0.05）.Conclusion When the alkaloids in mulberry leaves were extracted with 70% ethanol for 20 min at 50℃ twice，the yield of alkaloids was the highest.Mulberry leaf alkaloids have better preventive effects on hyperlipidemia and hyperglycemia.

Keywords：mulberry leaf;alkaloids;extraction technology;hypoglycemia;hypolipidemia

（责任编辑 唐建敏）