辣椒健康植株与患枯萎病植株根际土壤细菌群落多样性的比较研究

赖宝春 戴瑞卿 吴振强 李丰 林德峰 王家瑞

摘要：[目的]分析辣椒健康植株和患枯萎病植株根际土壤中细菌群落多样性，为辣椒枯萎病生态防控提供理论依据。[方法]采集漳州3个辣椒种植基地枯萎病典型患病样地的健康植株根际土壤（JK）和患病植株根际土壤（KW），对土样中的细菌群落进行基于IlluminaMiseq测序平台的宏基因组高通量测序，明确健康辣椒植株与枯萎病患病植株根际土壤细菌多样性。[结果]患枯萎病植株根际土壤细菌的优质序列比健康植株少14376条，OTUs少1239个。在门水平上，健康植株和患病植株根际土壤微生物组成相似，但相对丰度存在差异。在属水平上，健康植株根际的鞘氨醇单孢菌属Sphingomonas相对丰度比患病植株增加了5.05百分点;而金属细菌属Metallibacterium相对丰度比患病植株减少了6.09百分点。部分物种丰度分析表明患病辣椒土壤根际中壤红杆菌属Solirubrobacter、小双孢菌属Microbispora、短链球孢囊菌属Catelliglobosispora和假双头斧形菌属Pseudolabrys等4个属的物种丰度低于健康辣椒。[结论]辣椒患病植株根际土壤中的细菌群落结构发生改变及物种丰度降低是辣椒枯萎病患病的重要特征，提示早期添加优势益生菌是防控辣椒枯萎病的新思路。

关键词：辣椒枯萎病;根际土壤;高通量测序;细菌多样性

中图分类号：S436文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2019）09-1073-08

0引言

（研究意义）辣椒Capsicum annuum L是一种重要的经济作物，在我国各地广泛种植，其中福建漳州地区主要以种植反季节辣椒为主。由尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum Schl.引起的枯萎病给漳州辣椒产业造成极大的威胁。该病害是一种土传病害，病原菌从辣椒的根部侵入，引起根和茎基部维管束腐烂枯萎。有研究表明，土传病害的发生与土壤微生物多样性存在一定的相关性。病原菌在微生物多样性丰富的土壤中很难生存，土传病害的发生也会降低土壤微生物的多样性。植物根际土壤微生物是土壤生态系统中最活跃的部分，可促进植株生长，增强抗病性，在保护寄主植物免受病原菌侵染等方面有着重要的作用。因此，分析辣椒健康植株和枯萎病患病植株根际细菌多样性的变化以及微生物群落结构特征有助于进一步了解根际微生物对辣椒枯萎病发生的影响，对辣椒枯萎病的防治具有理论指導意义。（前人研究进展）有关辣椒枯萎病的研究主要集中在生防菌剂分离、筛选及防治方面的研究，如燕嗣皇等应用木霉菌剂防治辣椒枯萎病，田间试验结果表明每1hm用菌剂1.5kg即可有效防治辣椒枯萎病。杨卫娟等筛选到一株解淀粉芽孢杆菌对辣椒枯萎病菌具有较好的抑制作用。郑玉艳用苦参对辣椒枯萎病进行抑菌活性测定，结果表明苦参根中所含活性物质对辣椒枯萎病的菌丝和孢子萌发有较强的抑制作用。关于辣椒根际土壤微生物的研究主要集中在辣椒罹患疫病、不同套种模式、不同基质配方等对辣椒根际土壤微生物的影响方面。如周涛等运用高通量测序技术分析了3个地区辣椒疫病患病根际土壤细菌群落多样性，结果表明3个地区辣椒疫病根际土壤微生物组成相似，丰度存在差异。蔡艳等采用常规方法研究辣椒疫病健康株与患病植株根际土壤与根表土壤微生物数量、放线菌组成及拮抗性放线菌的分布。徐强等研究不同种植模式、作物种间不同的根部隔离处理对线辣椒根际与非根际土壤微生物量、酶活性及土壤养分含量的影响，并对其根际微生物的生态特征进行分析。赵玲等施用不同基质配方的有机肥于连作土壤中，可提高辣椒的产量和品质，改善辣椒根际土壤微生态结构。目前，未见相关辣椒健康植株与患病植株根际土壤微生物群落结构分析方面的研究报道。（本研究切入点）传统研究微生物的分析手段主要针对可培养微生物，不能准确分析土壤中微生物群落的多样性。运用高通量测序技术具有获得的信息量大、样品间平行性好等优点，可准确、全面地对样品中的细菌群落结构进行鉴定。（拟解决的关键问题）通过比较辣椒健康植株和枯萎病患病植株的根际土壤中细菌多样性，阐明辣椒根际土壤细菌多样性的变化对枯萎病发生的影响，为辣椒枯萎病的防控提供理论指导。

1材料和方法

1.1供试材料

土壤样品于2018年2-3月采自漳州市农业科学研究所（N24°33'13.20”，E117°42'10.98”）、南靖（N24°31'12.15"，E117°19'47.36"）和平和（N24°22'8.58"，E117°20'19.52"）3个枯萎病患病典型的辣椒种植基地，土壤样品分别命名为JK土和KW土。JK土为同一田块中健康植株根际土壤5点取样的混合土样;KW土为同一田块中患病植株根际土壤5点取样的混合土样.每个种植基地选取经分子鉴定为健康和患病植株各5株，取土时，去掉植株残枝，后用刀从茎基部开始逐渐小心地挖去上层土壤，追踪根系的伸展方向，后沿须根部分剪下，并将须根、茎带土取出，采用抖落法采集土壤。土样带回实验室后，置于阴凉通风处干燥并过20日土壤筛后，暂存-20℃冰箱.同时对3个基地采集的健康植株和患病植株根、茎分离纯化、致病性测定，鉴定所采集的病株致病菌为辣椒枯萎病菌后，将3个基地的JK土和KW土按相同比例分别混合均匀并分成2份，一份冻存于-20℃，冷冻干燥后用于提取土壤DNA，另一份冻存于-80℃备用;3个基地为常年种植同种辣椒品种，施肥管理条件一致，自然条件及土壤性质相似。

1.2DNA提取、PCR扩增和测序

称取200mg的样品，放人灭菌的2mL离心管中，加入1mL70%乙醇，震荡混匀，10000r·min室温离心3min，弃置上层液体。加入1×PBS溶液，振荡混匀，10000r·min室温离心3min，弃上层液体。倒置2mL管于吸水纸上1min，直至没有液体流出。将样品管放人55℃烘箱10min，使残留酒精完全挥发。然后使用OMEGA试剂盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取土壤样品基因组DNA。利用Qubit2.0DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，确定PCR反应需加入的DNA量。

以样品DNA为模板，使用细菌16S rDNA基因的通用引物341F和805R并融合Miseq测序平台的V3-V4区通用引物进行桥式PCR扩增（341F：3'-CCCTACACGACGCTCTTCC

GATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-5'：805R：3'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-5'），扩增体系：2×Taq master Mix15uL;10umol·Lprimer F 2uL;模板10～20ngDNA，加水至30uL。PCR反应程序：94℃3min;94℃30s，45℃ 20s，65℃ 30s，5个循环;94℃20s，55℃20s，72℃30s，20个循环;72℃5min。PCR结束后，PCR产物进行琼脂糖电泳检测，并用0.6倍的磁珠（AgencourtAMPureXP）对DNA进行纯化回收。利用Qubit 2.0DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量并进行高通量测序<生工生物工程（上海）股份有限公司>。

1.3序列数据分析

基于Illumina Miseq平台进行测序，对原始数据做质量控制（QC），利用Cutadapt（version 1.2.1）软件去除接头序列，用Pear（version 0.9.6）软件将成对序列进行拼接，调用Uchime（Version 4.2.40）软件检查并去除非特异性扩增序列及嵌合体，进行blastn比对，获得高质量序列。利用Usearch（version 5.2.236）软件对高质量序列进行聚类，相似性≥97%为同一分类操作单元（OTU），使用R的VennDiagram package（version 1.6.16）作图，通过Venn图呈现各样本共有的和独有的OTU数。应用Mothur（version 1.30.1）软件计算各样本的Chaol、Ace、Shannon、Simpson指数，利用R软件制作曲线图，分析样本微生物群落的Alpha多样性。通过RDP classifier（version 2.12）（数据库http：//rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp）方法进行物种分类，即采用Nalve Bayesian assignment算法對RDP分类阀值≥80%的序列进行门（phylum）、纲（class）、目（order）、科（family）、属（genus）各阶层分类，分析各分类层级水平上每个样本群落组成;利用STAMP（Version 2.1.3）软件进行样本间菌群丰度差异分析，基于物种分类结果，计算不同阶层水平上各rank的丰度，比较样本间丰度差异，找出样本间丰度存在显著差异的物种分类。

2结果与分析

2.1 Alpha多样性分析和OTUs（OperationalTaxonomic Units）差异比较

经测序分析获得2个样品根际土壤细菌的基因序列为101975条，QC过滤掉低质量序列后，有效序列的总数为95598条，有效率为93.75%;经过筛选后的优质序列数为75854条，其中，患病植株的根际土壤细菌的优质序列比健康植株根际减少14376条。图1所示，当测序数量>10000时，随着测序数量的增加，Shannon指数稀释曲线趋于平缓，说明测序数据量合理，可用于描述整个细菌的群落结构。Alpha多样性分析表明（表1），健康植株根际土壤的细菌群落多样性高于患病植株根际土壤。原始数据经质控后按97%的序列相似性可划分为8302个OTUs（图2）。其中，健康植株根际细菌检测到7164个OTUs，患病植株根际细菌检测到5925个OTUs，比健康植株根际减少了1239个。健康植株根际和患病植株根际土壤细菌特有OTUs所占比例各有差异，其中，健康植株根际细菌特有的OTUs占其总数的33.17%，患病植株根际细菌特有的OTUs数目占其总数的19.21%。说明患病植株根际细菌群落与健康植株根际细菌群落在OTUs水平上存在明显差异。

2.2细菌群落组成比较

采用Naive Bayesian assignment算法对健康植株和患病植株根际土壤细菌进行种系分类，测得的细菌群落所有序列可被注释到30个门、61个纲、79个目、179个科和516个属（表2）。在门的水平下，健康植株根际和患病植株根际占优势地位的门均为变形菌门Proteobacteria、酸杆菌门Acidobacteria、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes，但在相对丰度上表现一定的差异，其中Proteobacteria的相对丰度分别为49.86%和52.25%，Acidobacteria的相对丰度分别为14.17%和12.5%，Actinobacteria的相对丰度分别为7.39%和7.76%，Bacteroidetes的相对丰度分别为5.04%和6.95%。同一优势菌门Proteobacteria下，健康植株和患病植株的优势菌纲有所不同，健康植株根际土壤细菌最优势菌纲为α-变形菌纲Alphaproteobacteria，其相对丰度为28.66%，比患病植株增加了10.08百分点;而患病植株根际土壤细菌最优势纲为γ-变形菌纲Gammaproteobacteria，其相对丰度为29.04%，比健康植株增加了13.71百分点.属分类水平上，健康植株根际土壤优势菌属分别是鞘氨醇单孢菌属Sphingomonas、芽单孢菌属Gemmatimonas和产黄杆菌属Rhodanobacter;而患病植株根际土壤优势菌属分别是金属细菌属Metallibacterium、产黄杆菌属Rhodanobacter和鞘氨醇单孢菌属Sphingomonas;辣椒植株患枯萎病后，根际土壤中Sphingomonas和Gemmatimonas丰度分别减少了5.05百分点和2.2百分点，而Metallibacterium和Rhodanobacter丰度分别增加了6.09百分点和3.56百分点（表3）。

2.3物种丰度差异分析

基于物种分类结果，计算在不同水平上各rank的丰度，进一步比较健康植株根际和患病植株根际土壤细菌的物种丰度差异，利用软件STAMP作图，获得了3个基地健康植株和患病植株根际土壤细菌的物种差异比较图（图3），结果表明，属分类水平上，健康植株和患病植株根际土壤细菌的物种丰度存在差异。在95%置信区间内，壤红杆菌属Solirubrobacter、小双孢菌属Mierobispora、短链球孢囊菌属Catelliglobosispora和假双头斧形菌属Pseudo-labrys等4个属存在显著差异。

3讨论与结论

3.1 讨论

本研究通过Miseq测序平台对漳州3个种植基地的辣椒根际土壤进行宏基因组测序，测序数据量合理。Shannon指数、Chaol指数、ACE指数、Simpson指数等3个指标均表明辣椒患病植株根际土壤中的细菌多样性要低于健康植株。健康植株根际土壤比患病植株根际土壤拥有更多独有的OTUs，患病植株根际土壤细菌群落中越低的多样性表明植株发病程度越高，与前人研究结果一致。本研究比较了漳州3个种植基地辣椒健康植株和患病植株根际土壤样品的OTUs差异，结果显示比例存在明显差异，辣椒健康植株根际细菌特有的OTUs占其总数的33.17%，患病植株根际细菌特有的OTUs数目占其总数的19.21%，健康植株比患病植株特有的OTUs多13.96%。

Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes在所有的生物群中均占优势地位，且在细菌群落组成上差异不显著。很多研究结果表明，在各种不同土壤生态系统中细菌群落的优势门组成具有相似性。本研究中，门分类水平上，健康植株和患病植株根际土壤占优势地位的门都是Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes，与前人报道的研究结果一致。健康植株根际土壤细菌间和患病植株根际土壤细菌间优势门相对丰度存在差异，但丰度最高优势菌门都是Proteobacteria。同一优势菌门Proteobacteria下，健康植株根际际土壤细菌最优势菌纲为α-变形菌纲Alphaproteobacteria，其相对丰度为28.66%，比患病植株增加了10.08百分点;而患病植株根际土壤细菌最优势纲为γ-变形菌纲Gammaproteobacteria，其相对丰度为29.04%，比健康植株增加了13.71百分点。研究发现鞘氨醇单孢菌属Sphingomonas能够产生N-酰基.高丝氨酸内酯（AHLs）细菌信号分子，调控烟草植物抗病反应，AHLs在生物信息交流中也发挥着重要的作用，参与细菌多种生理行为的调控。鞘氨醇单胞菌广泛个分布在各种水体、土壤、大气以及極端环境中，有学者推测，鞘氨醇单胞菌能够进入植物体内与植物共生，并能够起到拮抗植物致病真菌的作用，同时它们又是一类致病菌，能引起植物根部或动物伤口的感染。本研究中辣椒健康植株根际土壤中的优势属为鞘氨醇单孢菌属，其相对丰度比患病植株高5.05百分点，鞘氨醇单孢菌在辣椒根际土壤中数量变化是否与辣椒植株患病直接关联，还有待进一步研究。下一步将从土壤中分离鞘氨醇单孢菌，研究其在辣椒土壤生态环境中的生理生化特征及其所具备的生态功能，对防控辣椒枯萎病具有重要意义。

Vasileiadis等报道壤红杆菌属能提高土壤硝化酶的活性，促进土壤微生物硝化作用;Mariana等研究表明，小双孢菌属对白色念珠菌Candidaalbicans、金色葡萄球菌Staphylococcus aureus等病原菌具有较好的抑制作用;短链球孢囊菌属可改善土壤中酶的活性，增加植物光合作用，促进植物生长;假双头斧形菌属是植物根际的有益细菌，能够促进植物对激素、生物碱以及氮的代谢等，进而促进植物的生长发育，提高植物抵抗病原菌的能力。本研究结果表明，辣椒健康和患病植株根际土壤细菌部分物种丰度差异显著，在95%置信区间内，壤红杆菌属Solirubrobacter、小双孢菌属Microbispora、短链球孢囊菌属Catelliglobosispora和假双头斧形菌属Pseudolabrys等4个属存在显著差异，这4个属的细菌在土壤中的功能表现为抑制病原菌、促进植物生长、提高土壤酶活性及代谢土壤中有害物质等。说明辣椒患病与根际土壤中壤红杆菌属、小双孢菌属、短链球孢囊菌属和假双头斧形菌属的物种丰度降低有关。

3.2结论

辣椒患病植株根际土壤中的细菌群落结构发生改变及物种多样性降低是辣椒枯萎病患病的重要特征。其中鞘氨醇单孢菌属为健康辣椒根际土壤的优势属，其在辣椒根际土壤中数量变化是否与辣椒植株患病直接相关，有待进一步研究。物种丰度差异分析表明患病辣椒土壤根际中壤红杆菌属、小双孢菌属、短链球孢囊菌属和假双头斧形菌属等4个属的物种丰度低于健康辣椒。该研究结果有助于我们从辣椒根际土壤中分离到能够与辣椒共生的优势益生菌，通过添加益生菌进一步验证辣椒枯萎病患病的原因，为早期预防或生态调控辣椒枯萎病提供新的思路。